乳腺癌細(xì)胞中HSP90α的分泌及其作用機(jī)制.pdf

1、引言：
　　熱休克蛋白90α(HSP90α)的研究是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。HSP90α是一種細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的分子伴侶蛋白質(zhì)，能與100多種目的分子結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞各項(xiàng)生理功能。雖然人們研究HSP90α幾十年，都知道細(xì)胞內(nèi)HSP90α的含量非常巨大，但是細(xì)胞內(nèi)HSP90α含量究竟是多少，卻沒(méi)有學(xué)者用實(shí)驗(yàn)的方法來(lái)測(cè)定。另外，人們普遍認(rèn)同很多腫瘤細(xì)胞能分泌HSP90α至細(xì)胞外，分泌型HSP90α反作用于細(xì)胞，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。可是，腫

2、瘤細(xì)胞的HSP90α分泌機(jī)制以及分泌的HSP90α如何反作用于細(xì)胞，這樣的研究卻相對(duì)較少。在此，我們實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)，對(duì)以上問(wèn)題做一探討。
　　目的：
　　1.通過(guò)實(shí)驗(yàn)的手段測(cè)定不同細(xì)胞內(nèi)HSP90α的含量，以期獲得較準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，解決HSP90α研究領(lǐng)域中一個(gè)重要的但卻被人們忽略的問(wèn)題。
　　2.觀察腫瘤細(xì)胞內(nèi)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF,HIF-1α和HIF-1β)對(duì)腫瘤細(xì)胞分泌HSP90α的影響。
　　3.檢測(cè)分泌至

3、細(xì)胞外的HSP90α是否依賴(lài)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（LRP1）對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控。
　　方法：
　　1.將已知量的重組人HSP90α純蛋白與細(xì)胞裂解液同時(shí)跑膠，用Westernblot法讓它們?cè)谕粡埬z片上曝光，通過(guò)比較膠片上細(xì)胞裂解液組與HSP90α純蛋白組的各點(diǎn)曝光斑密度值，計(jì)算細(xì)胞裂解液中HSP90α的含量。
　　2.培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，用小干擾RNA(siRNA)分別下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HIF-

4、1α和HIF-1β的表達(dá)水平，Westernblot法檢測(cè)細(xì)胞分泌HSP90α的情況。
　　3.培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，用小干擾RNA(siRNA)分別下調(diào)細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、HIF-1β和LRP1的表達(dá)水平，進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，觀察分泌型HSP90α對(duì)細(xì)胞的作用及其作用機(jī)制。
　　4.活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：使用嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(SCIDMice)作實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?×106個(gè)熒光素酶標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞(MDA-MB-2

5、31-Luc和MDA-MB-468-Luc)從尾靜脈注入小鼠。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組小鼠注射MDA-MB-231-Luc細(xì)胞；對(duì)照組小鼠注射經(jīng)siRNA下調(diào)了CD91水平的MDA-MB-231-Luc細(xì)胞和天生缺失CD91表達(dá)的MDA-MB-468-Luc細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行活體成像監(jiān)測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞內(nèi)HSP90α的含量：
　　HDF:2.33％±0.16;HKC:2.35％±0.26;HEMN-LP:2.25％±

6、0.62;HBL-100:3.47％±0.36;SCC-12:3.79％±1.31;MDA-MB-231:3.66％±0.21;A431:4.53％±0.70;M24:6.77％±1.56.
　　2.用siRNA下調(diào)HIF-1α或HIF-1β都能抑制MDA-MB-231細(xì)胞分泌HSP90α，此時(shí)的細(xì)胞遷移和侵襲能力降低。
　　3.下調(diào)了LRP1表達(dá)水平的MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力下降。
　　4.活體成像監(jiān)測(cè)顯示：

7、與注射下調(diào)了CD91水平的MDA-MB-231-Luc細(xì)胞和天生缺失CD91表達(dá)的MDA-MB-468-Luc細(xì)胞的對(duì)照組小鼠相比，注射MDA-MB-231-Luc細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組小鼠表現(xiàn)出較強(qiáng)的成瘤能力。
　　結(jié)論：
　　1.正常細(xì)胞內(nèi)HSP90α占細(xì)胞總蛋白含量的2-3％；而腫瘤細(xì)胞內(nèi)HSP90α則占細(xì)胞總蛋白含量的3-7％。
　　2.MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞表達(dá)HIF-1α→HIF-1α進(jìn)核與HIF-1β結(jié)合形成