HSP90與AMPK的相互作用研究.pdf

1、熱休克蛋白90(HSP90)是熱休克蛋白家族中重要的一員，它是細(xì)胞中表達(dá)量很高的一類分子伴侶。HSP90在胞漿內(nèi)主要以同源二聚體的形式存在，每個(gè)同源二聚體又由2個(gè)單體構(gòu)成。HSP90單體包括3個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域:有1個(gè)保守N末端結(jié)構(gòu)域、1個(gè)C末端結(jié)構(gòu)域和1個(gè)中間結(jié)構(gòu)域，中間結(jié)構(gòu)域和N端結(jié)構(gòu)域之間還有一個(gè)高電荷鉸鏈區(qū)將二者相連。HSP90除了可將新生肽鏈或非天然態(tài)的蛋白質(zhì)折疊成具有天然態(tài)的功能蛋白外，還參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子構(gòu)象的變化過程，通過對(duì)底

2、物蛋白的作用，影響疾病的發(fā)生和發(fā)展。其底物或稱“客戶蛋白”大多數(shù)是控制細(xì)胞復(fù)制和存活的包括腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，對(duì)HSP90的客戶蛋白參與細(xì)胞代謝的研究很少。
　　依賴于5’-AMP激活的蛋白激酶（AMPK）是一種蘇氨酸/絲氨酸激酶，酵母和哺乳動(dòng)物來源的AMPK都是由具有催化作用的α亞基、起調(diào)節(jié)作用的β亞基和起調(diào)節(jié)作用同時(shí)結(jié)合底物的γ亞基組成的異源三聚體。AMPK在細(xì)胞能量的動(dòng)態(tài)平衡中扮演了重要的角色，是維持細(xì)胞內(nèi)ATP:A

3、DP比率的腺苷酸激酶反應(yīng)的關(guān)鍵酶，就像細(xì)胞內(nèi)的“能量開關(guān)”，在細(xì)胞能量不足的狀態(tài)下會(huì)被激活，磷酸化多種底物，關(guān)閉ATP的消耗途徑，同時(shí)打開ATP的生成途徑。
　　已經(jīng)有研究表明HSP90和AMPK在體內(nèi)存在著某種聯(lián)系，然而還未見HSP90與AMPK存在直接相互作用的報(bào)道。在本文中，通過HSP90的體外ATP酶活實(shí)驗(yàn)、ForteBio OctetRed實(shí)驗(yàn)、BIAcore實(shí)驗(yàn)和GST Pull Down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了HSP90和細(xì)胞能量

4、代謝過程中的關(guān)鍵酶AMPK存在較強(qiáng)的相互作用，其中Fortebio OctetRed、BIAcore實(shí)驗(yàn)中得到二者的解離常數(shù)均約為10-8mol/L，并通過對(duì)HSP90的區(qū)段和AMPK的α、γ亞基及截短的α亞基片段之間的ForteBioOctetRed實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HSP90的N端、M端、C端與AMPK的α、γ亞基均存在較強(qiáng)的結(jié)合作用，解離常數(shù)均約為10-8mol/L，其中HSP90與AMPKα亞基的親和力略高于AMPKγ亞基，HSP90 N

5、端結(jié)構(gòu)域與AMPK的親和力略高于HSP90的M端和C端結(jié)構(gòu)域，表明HSP90的N端結(jié)構(gòu)域和AMPKα亞基可能是二者結(jié)合的主要區(qū)域。將AMPKα截短至催化區(qū)域的1-200位氨基酸，發(fā)現(xiàn)其仍能與HSP90發(fā)生特異性結(jié)合，揭示二者之間的結(jié)合位點(diǎn)中一定有某個(gè)或某幾個(gè)結(jié)合位點(diǎn)位于AMPKα亞基催化區(qū)域的前200個(gè)氨基酸中。在研究HSP90和AMPK的相互作用的同時(shí)嘗試引入小分子化合物，初步探討了小分子化合物對(duì)二者相互作用的影響，F(xiàn)orteBio

6、OctetRed先后結(jié)合系列實(shí)驗(yàn)中顯示同時(shí)與HSP90和AMPK存在較強(qiáng)結(jié)合作用的化合物Gambogic acid和al會(huì)干擾HSP90與AMPK之間的相互作用，而HSP90的專性抑制劑Geldanamycin未顯示出干擾作用。
　　這些研究及發(fā)現(xiàn)不僅擴(kuò)展了HSP90的客戶蛋白群，揭示了腫瘤細(xì)胞中HSP90參與脂肪酸代謝的新機(jī)制，同時(shí)對(duì)篩選針對(duì)HSP90-客戶蛋白相互作用的抑制劑的方法進(jìn)行了初步的研究，為尋找靶向更明確的藥物提供了