局灶節(jié)段腎小球硬化的轉錄組學研究.pdf

1、局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)作為導致成人及兒童激素抵抗腎病綜合征和腎功能衰竭最常見的原因之一，其病理生理機制仍不清楚。FSGS診斷依靠腎活檢，其病理特征包括局灶節(jié)段性腎小球硬化，和足突的彌漫融合。然而，由于病變小球往往位于皮質(zhì)深部接近髓質(zhì)處，腎活檢易遺漏，給FSGS的診斷帶來一定困難。FSGS根據(jù)病因可分為原發(fā)性、繼發(fā)性和家族性。家族性FSGS（Familial

2、FSGS，F(xiàn)FSGS）也叫遺傳性FSGS，占非繼發(fā)性FSGS9％左右。FSGS患者臨床通常表現(xiàn)為大量蛋白尿，部分表現(xiàn)為腎病綜合征范圍的蛋白尿，對這部分患者治療主要包括激素和免疫抑制劑，根據(jù)對足量激素的療效可分為激素敏感、激素依賴和激素抵抗，激素依賴和抵抗患者容易進展至終末期腎臟病(ESRD)。
　　轉錄組學是從RNA水平研究基因表達情況的研究方法。以往報道關于FSGS的轉錄水平的研究，采用材料多來自腎組織（包括腎小球和小管間質(zhì)）的

3、石蠟標本，由于FSGS為足細胞疾病，納入腎小管和間質(zhì)將造成結果偏差，此外石蠟組織中RNA的降解難以避免。因此，本研究在倒置顯微鏡下分離FSGS患者活檢腎組織中的腎小球，最大限度的保持患者腎小球轉錄本的完整性。并通過高通量的Microarray分析方法直接對患者腎小球的轉錄本進行研究，以期從轉錄水平上，發(fā)現(xiàn)FSGS的發(fā)病機制。此外，本研究不僅入選原發(fā)性FSGS患者，還入選攜帶基因突變的遺傳性FSGS患者和激素抵抗FSGS患者，將從不同角度

4、，全面探討FSGS的轉錄組表達差異，從而深入了解FSGS的致病機制。
　　本研究第一部分納入6例原發(fā)性FSGS患者，5例MCD患者，兩組患者接受腎穿刺時均未接受激素和/或免疫抑制劑治療，且所有入組患者都表現(xiàn)為激素敏感，排除治療反應的差異對Microarray結果的影響。倒置顯微鏡下極細尖頭鑷分離患者腎活檢皮質(zhì)組織中腎小球，對兩組患者腎小球的轉錄本進行Microarray分析，重點對兩種疾病的基因表達的差異進行了詳盡的分析。Micr

5、oarray結果提示，F(xiàn)SGS與MCD患者腎小球轉錄本相比:參與生殖細胞形成、泛素化過程、蛋白刺激反應、肌肉收縮的調(diào)節(jié)、細胞增生和骨骼系統(tǒng)發(fā)育的基因高表達;而參與合成和分解代謝過程、細胞內(nèi)轉運、氧化還原反應、細胞定位的形成的基因低表達。并通過RT-PCR方法在另外7例FSGS與7例MCD患者腎小球轉錄本中驗證相關基因的表達趨勢與Microarray結果一致。并發(fā)現(xiàn)膜金屬肽鏈內(nèi)鈦酶（membrane metallo endopeptida

6、se，MME）蛋白在FSGS患者腎小球中的表達量明顯低于MCD患者，提示MME可作為潛在的區(qū)別FSGS、MCD的生物學標志物，同時提示MME可能參與FSGS的發(fā)生。
　　除了原發(fā)性FSGS，以往研究發(fā)現(xiàn)一部分家族性FSGS患者為足細胞相關分子突變引起，提示與原發(fā)性FSGS存在不同機制。本課題組前期研究在漢族人FSGS家系中成功發(fā)現(xiàn)COL4A3基因雜合突變可引起漢族人家族性FSGS。本研究第二部分，納入3例攜帶Ⅳ型膠原α3鏈（COL

7、4A3）基因突變的FFSGS患者(C1616Y，G801R，L737H)和5例MCD患者。通過對其臨床資料的回顧性整理統(tǒng)計，觀察FFSGS與MCD兩組患者臨床特點的差別，結果顯示與MCD相比，攜帶COL4A3基因突變FFSGS患者發(fā)病較早，較少發(fā)生腎病綜合征，合并鏡下血尿較多，尿蛋白水平較低，血漿白蛋白水平較高，腎活檢時FFSGS患者腎小球濾過率較低。對兩組患者腎小球的轉錄本進行Microarray分析，結果顯示攜帶COL4A3基因突變

8、的FFSGS患者腎小球轉錄本與MCD患者腎小球轉錄本相比，參與細胞間及細胞表面受體信號傳導、神經(jīng)信號傳遞、認知、感官直覺、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路的基因呈現(xiàn)高表達;而參與合成及分解代謝、蛋白質(zhì)裂解及泛素化過程，和細胞內(nèi)轉運過程的基因呈現(xiàn)低表達。挑選前6位上調(diào)，和前6位下調(diào)表達的基因，采用RT-PCR方法在相同患者腎組織轉錄本中驗證相關基因的表達趨勢，結果顯示相關基因表達趨勢與Microarray結果一致。GBM主要由Ⅳ型膠原（COL4A3

9、）組成，在臨床工作中，一部分FSGS患者活檢腎組織GBM在EM下呈節(jié)段性改變，但該病理改變的機制以及臨床意義不明。此外，先前研究本課題組發(fā)現(xiàn)，COL4A3基因雜合突變攜帶者可見GBM節(jié)段性變薄，與典型薄基底膜腎病(TBMN)以及AS的電鏡下特征不同。因此我們通過分析合并GBM節(jié)段變薄的FSGS患者與GBM無病變的FSGS患者的臨床、病理數(shù)據(jù)，以期發(fā)現(xiàn)GBM節(jié)段變薄對患者臨床、病理以及預后的影響。通過對63例合并GBM局灶變薄的FSGS患

10、者與60例GBM無病變的FSGS患者臨床資料的比較分析，結果顯示與GBM無病變的FSGS患者相比，合并GBM局灶變薄的FSGS患者尿蛋白水平明顯較高，血漿白蛋白水平較低，腎小球濾過率較低，且血紅蛋白水平較低。兩組患者腎病綜合征、血尿的比例，病理表現(xiàn)以及治療反應未見明顯差異。
　　FSGS的主要治療包括激素和免疫抑制劑，根據(jù)以往數(shù)據(jù)顯示，大約1/3FSGS患者對激素治療反應差，但具體機制不明。本研究第三部分通過納入6例臨床表現(xiàn)為激素

11、敏感腎病綜合征(SSNS)的原發(fā)性FSGS患者，3例臨床表現(xiàn)為激素抵抗腎病綜合征(SRNS)的原發(fā)性FSGS患者，對兩組患者腎小球的轉錄本進行Microarray分析，觀察兩組患者基因表達的差異。結果顯示與FSGS-SSNS患者腎小球轉錄本相比，F(xiàn)SGS-SRNS患者腎小球轉錄本中:參與細胞內(nèi)氨基酸及其衍生物代謝，離子轉運過程的基因呈現(xiàn)高表達;而參與人體器官組織形成、DNA依賴的轉錄過程調(diào)節(jié)、MAPK活性的負向調(diào)控的基因呈現(xiàn)低表達。RT

12、-PCR驗證結果顯示相關基因的表達趨勢與Microarray結果一致。免疫組織化學結果顯示STRA6(stimulated by retinoic acidgene6 homolog)基因編碼蛋白在FSGS-SRNS患者腎小球中的表達量明顯低于FSGS-SSNS患者。提示STRA6的低表達可能與SRNS的FSGS發(fā)生有關，因此，我們提出STRA6可作為鑒別FSGS治療反應的潛在的生物學標志物，同時提示STRA6可能參與FSGS-SRNS

13、的發(fā)生。
　　綜上所述，本研究入選臨床特征為SSNS的原發(fā)性FSGS患者，遺傳性FSGS患者（攜帶COL4A3雜合突變）和SRNS的FSGS患者，入選MCD患者作為對照組，通過轉錄組學分析，得到了FSGS的轉錄組表達圖譜。結果顯示:SSNS患者，遺傳性FSGS患者與MCD患者腎小球轉錄本表達差異明顯。與SSNS患者相比，SRNS患者腎小球轉錄本差異明顯。差異表達的基因中，參與生殖細胞形成、泛素化過程、合成和分解代謝過程等的基因在S

14、SNS和MCD患者中表達差異明顯;參與細胞間及細胞表面受體信號傳導、神經(jīng)信號傳遞、認知、感官直覺、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路的基因;參與合成及分解代謝、蛋白質(zhì)裂解及泛素化過程，和細胞內(nèi)轉運過程的基因，在遺傳性FSGS和MCD患者中表達差異明顯;參與細胞內(nèi)氨基酸及其衍生物代謝、離子轉運過程、人體器官組織形成、DNA依賴的轉錄過程調(diào)節(jié)等的基因在SRNS與SSNS患者中表達差異明顯。
　　MME基因及其編碼蛋白在FSGS患者腎小球中的表達量

15、明顯低于MCD患者，提示MME可作為潛在的區(qū)別FSGS、MCD的生物學標志物，同時提示MME可能參與FSGS的發(fā)生。STRA6基因及其編碼蛋白在SRNS的FSGS患者腎小球中的表達量明顯低于SSNS的FSGS患者。提示STRA6可作為鑒別FSGS治療反應的潛在的生物學標志物，同時提示STRA6可能參與FSGS-SRNS的發(fā)生
　　我們發(fā)現(xiàn)一部分散發(fā)性FSGS患者也表現(xiàn)為GBM節(jié)段性變薄，進一步分析合并與不合并GBM節(jié)段變薄的FSG