四種藥物致Balb-c小鼠肝臟毒性的基因表達譜研究.pdf

1、藥物不良反應是長期以來危害人體健康的一個醫(yī)學難題，當前各國由藥物不良反應所引發(fā)的疾病都呈上升趨勢，同時它也是眾多新藥開發(fā)和臨床運用的難題和障礙，對藥物毒性機制進行深入研究有重要的醫(yī)學和社會意義，但傳統(tǒng)的藥物毒理學研究缺乏在分子水平上進行綜合分析的手段，使藥物毒理研究與發(fā)展相對滯后。 毒理基因組學為藥物毒理研究引入了新的研究理論和技術手段，基因芯片等高通量基因組技術手段可以同時觀察藥物毒性作用引發(fā)的數(shù)以千計的基因的表達變化模式，而

2、這種基因表達譜上所顯現(xiàn)的毒性終點往往具有較好的敏感性和特異性，有助于對毒性機制的闡明。目前此方面工作正在廣泛開展并取得許多成果。肝臟是人體藥物代謝的主要器官，藥物引發(fā)的肝毒性損傷占臨床藥物不良反應的相當比例，因此眾多研究均從藥物肝毒性動物模型入手。 本課題是以本室與香港城市大學聯(lián)合構建的小鼠毒理基因芯片為技術平臺，建立四種具肝毒性效應的臨床藥物(紅霉素、四環(huán)素、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺)的Balb/c小鼠肝毒性模型，對比研究各藥物作

3、用后不同時相點和劑量點小鼠肝臟基因表達譜變化，為在分子水平上探索藥物肝臟毒性作用機制積累資料，同時驗證本實驗室與香港城市大學聯(lián)合構建的小鼠毒理基因芯片用于藥物毒性評價的可行性。本研究分為三部分進行：第一部分，建立四種藥物致Balb/c小鼠肝毒性損傷模型；第二部分，設計制作小鼠毒理基因芯片，建立相應芯片檢測流程，并進行相關質(zhì)控分析和可靠性驗證；第三部分，利用小鼠毒理基因芯片觀察各實驗組小鼠肝臟基因表達譜變化，并結合聚類分析及生物信息數(shù)據(jù)庫

4、檢索等手段對數(shù)據(jù)進行初步分析，探討藥物致肝臟毒性的作用機制。主要的結果如下： 1.本研究建立了紅霉素、四環(huán)素、環(huán)磷酰胺和異環(huán)磷酰胺四種藥物的Balb/c小鼠不同時相和劑量的肝毒性作用模型，體重指標統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)多個藥物組動物平均體重下降，提示動物機體能量代謝障礙；各組動物血漿肝功生化指標和肝臟病理切片觀察發(fā)現(xiàn)各藥物引起肝臟不同程度和類型的毒性損傷。 2.挑選與環(huán)境化合物致癌、外來化合物/藥物代謝及毒性效應相關的1796個基因片

5、段，構建小鼠毒理基因芯片及配套數(shù)據(jù)庫。 3.建立本芯片的樣本RNA提取、芯片雜交和數(shù)據(jù)分析方案，采用局部均值化標準化方法對原始數(shù)據(jù)進行標準化校正。 4.評估本芯片質(zhì)量監(jiān)測指標并進行包含熒光交換重復的差異表達重復性實驗，結果顯示芯片雜交結果片內(nèi)數(shù)據(jù)特異性和重復性均較好，片間數(shù)據(jù)相關性較好。抽檢芯片雜交結果部分基因進行熒光定量PCR驗證，發(fā)現(xiàn)變化趨勢基本一致，證實芯片結果可靠性。 5.芯片檢測各藥物組基因表達譜，共篩

6、選差異表達基因302個，按GeneOntology功能分類標準進行了功能檢索分類。 6.分層聚類法對各藥物組表達譜分別進行了樣本聚類和基因聚類。樣本聚類結果顯示，環(huán)磷酰胺和異環(huán)磷酰胺組聚類接近，紅霉素和四環(huán)素組聚類接近，四環(huán)素和環(huán)磷酰胺兩個低劑量組在樣本聚類中分類特征不明顯。基因聚類結果顯示在多個藥物組中呈現(xiàn)共同下調(diào)趨勢的基因有46個，共同上調(diào)趨勢基因51個，分別涉及脂肪轉運、能量代謝、抗氧化、炎癥發(fā)生和免疫調(diào)節(jié)、信號轉導和細胞

7、周期調(diào)控、藥物代謝等多種功能機制。 7.綜合分析不同生物學功能類別的差異基因表達變化，提示各藥物組可能分別存在以下一些與毒性效應和機體調(diào)節(jié)相關的機制：肝臟脂肪酸分解代謝和脂肪轉運功能的障礙，可能導致脂質(zhì)蓄積和過氧化發(fā)生；肝臟組織細胞修復再生和蛋白質(zhì)降解均較活躍；機體能量代謝障礙；肝臟組織存在藥物作用后的氧化應激反應，藥物抑制部分抗氧化基因表達；肝臟組織一些炎癥應激基因上調(diào)，部分免疫調(diào)節(jié)功能基因受抑；眾多信號轉導通路和細胞周期調(diào)控

8、相關基因發(fā)生改變，總體趨勢傾向于促進細胞凋亡發(fā)生。部分藥物轉運及Ⅰ、Ⅱ相代謝途徑相關基因受抑，影響藥物肝臟代謝作用。 8.比較四環(huán)素和環(huán)磷酰胺低劑量組與高劑量組表達譜，差異表達一致率較低，提示不同作用劑量下基因表達調(diào)控存在不同的模式。差異表達一致的基因反映在不同劑量下共同存在的毒性效應機制，但并無明顯的量效關系。僅在兩低劑量藥物組差異表達的基因推測主要與細胞對藥物作用的適應性反應相關。 綜合以上研究結果我們認為，本室與香