鼠頰黏膜干細(xì)胞的分離及鑒定.pdf

1、國(guó)內(nèi)外學(xué)者已證明骨髓、脂肪、皮膚和神經(jīng)等多種組織中含有成體干細(xì)胞，口腔醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域也已發(fā)現(xiàn)牙髓和牙周組織中有成體干細(xì)胞存在。鑒于口腔黏膜與皮膚表皮均是由外胚層發(fā)育而來(lái)，且存在相似的組織結(jié)構(gòu)，本課題借鑒皮膚表皮干細(xì)胞分離及鑒定方法分離鼠頰黏膜干細(xì)胞，探索口腔黏膜干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)和純化方法，獲得穩(wěn)定生長(zhǎng)的鼠頰黏膜干細(xì)胞。 第一章鼠頰黏膜干細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 目的：探討鼠頰黏膜干細(xì)胞體外分離和培養(yǎng)方法，并初步純化。

2、方法：DispaseⅡ酶和Trypsin-EDTA兩步法分離昆明小鼠頰黏膜上皮細(xì)胞，接種在以NIH3T3細(xì)胞為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)板中。DMEM培養(yǎng)24h后換用黏膜干細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，部分細(xì)胞72h后行成骨、成脂誘導(dǎo)和AKP染色鑒定；部分細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)5d后，消化轉(zhuǎn)移至Ⅳ型膠原預(yù)包被的培養(yǎng)板中，加入黏膜干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察細(xì)胞克隆形成和成骨、成脂誘導(dǎo)、CK和AKP染色。 結(jié)果：初次分離的上皮細(xì)胞群83.96％處于G0/G1期，培養(yǎng)72

3、h后可見(jiàn)克隆樣生長(zhǎng)細(xì)胞，成骨、成脂誘導(dǎo)和AKP染色均呈陽(yáng)性；細(xì)胞在Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)板上快速貼壁，呈圓形或卵圓形，胞體較小，折光性較強(qiáng)，克隆樣生長(zhǎng)，成骨、成脂誘導(dǎo)和CK、AKP染色均呈陽(yáng)性，3w后干細(xì)胞以自己為中心向周圍分化。 結(jié)論：運(yùn)用滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法可獲得大量干細(xì)胞樣上皮細(xì)胞，Ⅳ型膠原黏附結(jié)合黏膜干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)法可實(shí)現(xiàn)鼠頰黏膜干細(xì)胞的初步純化。 第二章p63蛋白在鼠頰黏膜干細(xì)胞的表達(dá) 目的：檢測(cè)p63蛋白在

4、鼠頰黏膜干細(xì)胞中的表達(dá)。 方法：以鼠抗人/鼠p63蛋白為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠為二抗，免疫熒光顯微鏡檢測(cè)p63蛋白在BcaCD885細(xì)胞和鼠頰黏膜干細(xì)胞的表達(dá)。 結(jié)果：在免疫熒光顯微鏡下觀察，兩種細(xì)胞胞核中均發(fā)出p63蛋白的綠色熒光，鼠頰黏膜干細(xì)胞克隆樣生長(zhǎng)區(qū)域熒光亮度高于已分化細(xì)胞和BcaCD885細(xì)胞。 結(jié)論：p63蛋白在鼠頰黏膜干細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)，可作為鑒定該細(xì)胞的分子表面標(biāo)志，同時(shí)為“癌癥起源于正常成體