中華倒刺鲃胰蛋白酶的cDNA克隆與序列分析.pdf

1、胰蛋白酶(Trypsin)是動物消化道中一種主要的堿性蛋白水解酶，屬于絲氨酸蛋白酶家族，專一性水解賴氨酸或精氨酸羧基形成的肽鍵。其主要功能一是消化蛋白質(zhì)食物，二是激活所有胰腺分泌的酶原，它可以有力迅速地激活其他蛋白酶原(糜蛋白酶原、羧肽酶原、彈性蛋白酶原)而行使消化功能。在脊椎動物中，由胰臟的腺泡細(xì)胞的核糖體產(chǎn)生無活性的前體——胰蛋白酶原(Trypsinogen)再進(jìn)入胰腺運(yùn)輸管，最后釋放到腸腔，在那里被腸黏膜細(xì)胞分泌的腸激酶活化而生成

2、有活性的胰蛋白酶。通過比較不同動物編碼胰蛋白酶的mRNA序列，可以了解其胰蛋白酶的結(jié)構(gòu)特點以及與功能之間的關(guān)系，進(jìn)而揭示不同動物對蛋白質(zhì)消化能力差異的原因。本研究對中華倒刺鲃胰蛋白酶原mRNA進(jìn)行了克隆和序列測定，并對其核苷酸序列及推導(dǎo)氨基酸序列以及預(yù)測的蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，主要研究結(jié)構(gòu)如下： 1中華倒刺鲃胰蛋白酶基因的全長cDNA序列在對多種硬骨魚類的胰蛋白酶基因進(jìn)行了多重比對后設(shè)計了2個特異性3'RACE引物，以來自中

3、華倒刺鲃胰腺的mRNA為模板擴(kuò)增得到了中華倒刺鈀胰蛋白酶的3’端序列。根據(jù)得到的3’端序列設(shè)計了一個用于擴(kuò)增胰蛋白酶基因的中間片段的下游引物，又根據(jù)斑馬魚的胰蛋白酶基因序列設(shè)計了一個上游引物，從而得到了中華倒刺鲃胰蛋白酶的中間片段序列。再根據(jù)得到的中間片段序列設(shè)計了兩組5'RACE特異性引物，從而得到了中華倒刺鈀胰蛋白酶的5’段序列。 對所得到的三段序列進(jìn)行拼接，得到了中華倒刺鲃胰蛋白酶的cDNA序列，它全長850bp，5’非編

4、碼區(qū)為29bp，編碼區(qū)包括738個核苷酸，編碼一個長246個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)前體，3’非編碼區(qū)為80bp。 2中華倒刺鲃胰蛋白酶基因推導(dǎo)氨基酸序列的分析克隆得到的中華倒刺鲃胰蛋白酶的cDNA全長850bp，包括一個5’非編碼物、一個編碼246個氨基酸的開放閱讀框、TAA終止密碼子和一個包括加尾信號和poly(A)尾的3’非編碼區(qū)。編碼區(qū)核苷酸長度為738bp，編碼246個氨基酸，由信號肽(14個氨基酸)、激活肽(8個氨基酸)、

5、催化三聯(lián)體氨基酸殘基(His-63，Asp-107,Ser-200)以及決定底物特異性的保守性天冬氨酸殘基(Asp-194)、12個半胱氨基酸殘基和聯(lián)接肽構(gòu)成。 3中華倒刺鲃胰蛋白酶基因推導(dǎo)蛋白的分析及其結(jié)構(gòu)預(yù)測預(yù)測胰蛋白酶基因編碼一個246個氨基酸的多肽鏈，分子量Mw=26552Da，等電點pI=7.54。在氨基酸組成上，絲氨酸(Ser)含量最高，為11.79﹪；其次是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸及亮氨酸，分別為8.94﹪、8.13