TIPE2在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細胞中的表達及其意義.pdf

1、目的：TIPE2(tumor necrosis factor-α induced protein8 like2)是2002年新發(fā)現(xiàn)的一個維持免疫系統(tǒng)自穩(wěn)平衡必需的基因之一，屬于TIPE家族成員之一，編碼的蛋白中含有6個α螺旋和類似死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(death effect domain,DED)的結(jié)構(gòu)域，?？梢院腿鏑aspase8等含有DED結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)合，發(fā)揮抑制凋亡的作用[1]。其高分辨率晶體結(jié)構(gòu)顯示該分子中間存在一個巨大的疏水性凹

2、槽，猜測可能是與協(xié)同因子結(jié)合的部位。研究表明，將小鼠的TIPE2基因敲除后，小鼠表現(xiàn)為體重下降、脾腫大、多器官出現(xiàn)自發(fā)性炎癥，且炎癥反應(yīng)加劇，細胞實驗發(fā)現(xiàn)TIPE2抑制NF-kB信號通路的活化。初步研究證明它是一種新型的負性免疫調(diào)節(jié)蛋白在固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中均發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用。
　　 目前關(guān)于TIPE2的研究很少，并且主要來自小鼠，關(guān)于TIPE與人類疾病的關(guān)系研究也非常少。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)人類系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和乙

3、型肝炎患者外周血單個核細胞中TIPE2 mRNA的表達顯著降低，并且與疾病病情發(fā)展有關(guān)，而TIPE2與其他人類自身免疫性疾病的關(guān)系尚不清楚。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是以慢性對稱性多關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的一種全身性疾病。目前病因尚不明確，一般認為是感染后引起的自身免疫反應(yīng)，招致以滑膜炎為基礎(chǔ)的關(guān)節(jié)病變，免疫細胞參入了整個炎癥過程。TIPE2作為一種新的免疫負調(diào)控分子是否參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)過程?目前尚未見報道。
　　 為了研究TIPE2表

4、達特點及其與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)系，本研究通過采集類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人發(fā)作期時的外周血單個核細胞，采用實時熒光定量PCR的方法檢測了TIPE2的表達水平，并分析了TIPE2表達與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床指標的關(guān)系，對揭示人TIPE2的功能以及在疾病中的作用提供了線索。。
　　 材料與方法：
　　 1.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細胞中TIPE2表達的檢測
　　 1.1 病例的選擇與標本的收集：
　　 根據(jù)實驗方案的要求

5、，收集2010年3月到2010年9月類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)作期時的病例50例，全部符合1987年美國風(fēng)濕病協(xié)會(ARA)修訂的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷標準[5]。同時選取30例年齡與性別相匹配的非類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎即正常健康人，為下一步實驗作好物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 1.2 外周血單個核細胞總RNA的抽提及cDNA的制備Trizol法抽提外周血單個核細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA的濃度及純度，波長為260/280nm處的吸光度值為1.8～2.0

6、時用于實驗，統(tǒng)一定量為2μg，反轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。
　　 1.3 半定量RT-PCR及實時熒光定量RT-PCR法檢測TIPE2基因的表達根據(jù)引物設(shè)計的原則，應(yīng)用PremierPrimer5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計引物，為了避免基因組DNA受到污染，因此所設(shè)計引物均跨不同外顯子。應(yīng)用半定量RT-PCR及實時熒光定量RT-PCR法檢測類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者和健康對照者新鮮分離的PBMCs中TIPE2基因的表達。
　　 2

7、.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)指標的檢測利用RA病人外周血，根據(jù)臨床常規(guī)方法，檢查類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)指標：如血沉，抗鏈“0”，類風(fēng)濕因子，C反應(yīng)蛋白等指標。
　　 3.統(tǒng)計學(xué)處理利用Prism GraphPad軟件對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細胞TIPE2的表達與健康對照人群TIPE2的mRNA的表達的相關(guān)性分析，以及與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎臨床參數(shù)等進行相關(guān)性分析，所有計量資料以均數(shù)士標準差(X±S)表示，以α=0.05作為檢驗水準。繪制散

8、點圖后對TIPE2進行直線相關(guān)分析，以P=0.05作為相關(guān)系數(shù)的檢驗水準。兩組間比較采用t檢驗。
　　 結(jié)果：
　　 1.TIPE2 mRNA在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者PBMCs中的表達明顯高于健康對照組采用RT-PCR法即實時熒光定量方法檢測RA患者和健康對照人群TIPE2mRNA的表達。根據(jù)MJ-Research實時熒光定量擴增儀的性能和擴增產(chǎn)物的特性，用2-△△CT來表達所表達基因的表達水平。依據(jù)MJ-Research實

9、時熒光定量擴增儀擴增產(chǎn)品專業(yè)分析軟件，可以得到所檢驗的RA患者和正常對照人的TIPE2表達水平。結(jié)果顯示RA患者外周血單個核細胞中的TIPE2表達水平為0.0129±0.0122，正常健康對照人的TIPE2表達水平為0.0056±0.0046，經(jīng)t檢驗得P值為0.0089，可以得到TIPE2表達水平在所檢驗的RA患者和正常對照者中有顯著的差異，其表達在RA患者中比正常對照者中的表達明顯增高。
　　 2.高表達TIPE2的類風(fēng)濕性

10、關(guān)節(jié)炎患者血沉明顯高于低表達TIPE2的患者為了分析TIPE2表達與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者臨床指標的關(guān)系，我們以TIPE2表達的平均值為線，平均值以上為高表達組，平均值一下為低表達組，比較TIPE2高表達組和低表達組患者血沉(ESR)的水平的差異，發(fā)現(xiàn)TIPE2高表達組RA患者外周血ESR的水平明顯高于TIPE2低表達組病人(p=0.0428)，血沉是RA病情的重要指標，提示TIPE2的水平與RA的嚴重程度有關(guān)。
　　 3.高表達T

11、IPE2的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者類風(fēng)濕因子的水平明顯高于低表達TIPE2的患者水平為了進一步確定TIPE2的水平與RA的嚴重程度的關(guān)系，我們進一步分析了TIPE2表達與RA患者類風(fēng)濕因子的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)高表達TIPE2的RA患者類風(fēng)濕因子明顯高于低表達TIPE2的患者(p=0.0272)4．TIPE2表達的高低對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清C反應(yīng)蛋白(CRP)及抗鏈球菌“0”(ASO)無明顯影響C反應(yīng)蛋白(CRP)及抗鏈球菌“O”(ASO)也是RA常規(guī)

12、的臨床檢測指標表達TIPE2的RA患者與低表達TIPE2RA患者間C反應(yīng)蛋白及ASO水平無顯著性差異(CRP:p=0.3333，ASO:p=0.8979)，表明TIPE2表達的高低對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清C反應(yīng)蛋白(CRP)及抗鏈球菌“0”(ASO)無明顯影響。
　　 結(jié)論：
　　 1．TPE2-mRNA在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者PBMCs中的表達明顯高于健康對照組。
　　 2．高表達TIPE2的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血沉和

13、類風(fēng)濕因子的水明顯高于低表達TIPE2的患者。
　　 3．TIPE2表達的高低對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清C反應(yīng)蛋白(CRP)及抗鏈球菌“0”(ASO)無明顯影響創(chuàng)新性和意義TIPE2是新發(fā)現(xiàn)的基因，與疾病的關(guān)系尚不清楚。目前關(guān)于TIPE2功能及特性的研究多來自小鼠，TIPE2在人類各種自身免疫性疾病中的特性尚不清楚。本研究首次發(fā)現(xiàn)人TIPE2在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)作期高表達于單個核細胞，且高表達TIPE2的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血沉和類風(fēng)濕因