FSHR B細(xì)胞表位篩選及其多肽疫苗抗生育作用的研究.pdf

1、世界人口的持續(xù)快速增長，男性愿意共同承擔(dān)計(jì)劃生育的責(zé)任，因此開發(fā)新型的男性避孕方法是當(dāng)務(wù)之急。避孕疫苗(contraceptive vaccine，CV)具有高效、安全、經(jīng)濟(jì)、可逆等優(yōu)點(diǎn)，是目前避孕研究中極具前景的研究熱點(diǎn)之一。避孕疫苗根據(jù)其作用的靶點(diǎn)不同，分為靶向配子的產(chǎn)生、配子的功能和配子的結(jié)局三類。男性避孕疫苗主要是通過干擾激素調(diào)控的精子發(fā)生、抑制精子活動(dòng)力或是精卵相互作用過程中的任何一步達(dá)到抑制生育的作用。 卵泡刺激素(

2、follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)通過與其特異性表達(dá)于睪丸支持細(xì)胞(Sertoli cell，SC)的受體(FSHR)結(jié)合來啟動(dòng)和維持男性的精子發(fā)生。因而FSHR可作為男性避孕疫苗的靶抗原之一。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR的胞外區(qū)(extracellular domain，ECD)存在多個(gè)參與激素受體結(jié)合或信號(hào)傳導(dǎo)的不連續(xù)區(qū)域。既往的研究采用單抗或多抗探針、噬菌體展示技術(shù)、肽競爭結(jié)合或表位作圖的方法來篩選激素受體結(jié)

3、合的位點(diǎn)，但是篩選出的位點(diǎn)用于抗生育力研究的較少，或是抑制生育力效果欠佳。 附睪蛋白酶抑制劑(epididymis protease inhibitor，Eppin)表達(dá)于精子頂體后區(qū)、睪丸的支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和圓形精子以及附睪上皮的主細(xì)胞，可能與精子的成熟密切相關(guān)。射精后覆蓋于精子表面的Eppin與精液凝固蛋白(semenogelin，Sg)飽和性結(jié)合，為精子提供抗菌作用。研究顯示重組Eppin蛋白免疫雄猴能顯著抑制雄猴的生育

4、力，停止免疫后71％雄猴能恢復(fù)生育力，因此Eppin是開發(fā)避孕疫苗的候選抗原。 因此本研究的目的在于篩選FSHR的優(yōu)勢中和性B細(xì)胞表位，觀察多肽疫苗抗生育的有效性和安全性。本研究將hFSHR ECD按蛋白質(zhì)氨基酸序列分為1-140aa和120-350aa兩段，通過基因擴(kuò)增和構(gòu)建原核表達(dá)載體，從而誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)并純化。通過ECD二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析、在線B細(xì)胞表位預(yù)測和分子對(duì)接技術(shù)最后選定了4個(gè)候選肽，聯(lián)合泛DR輔助T細(xì)胞表位(pan-

5、DR epitope，PADRE)合成融合肽段。采用蛋白初次免疫.候選肽強(qiáng)化免疫的策略免疫成年雄性B alb/C小鼠，觀察各表位肽激發(fā)抗體的產(chǎn)生及對(duì)小鼠生育力的影響。由于單一針對(duì)FSHR所獲得的避孕效應(yīng)只能中等程度的抑制小鼠生育力，因此聯(lián)合Eppin免疫，以觀察多價(jià)疫苗對(duì)生育力的抑制效應(yīng)。以重組蛋白疫苗為對(duì)照，分析表位肽疫苗的抗生育潛能和安全性。 方法： 1. hFSHR ECD和Eppin原核蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

6、hFSHR ECD的1-140aa段和120-350aa段基因分別采用橋連拼接PCR擴(kuò)增，Eppin基因序列以人睪丸cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得。目的基因連入pET32a載體，ImMIPTG誘導(dǎo)原核蛋白表達(dá)，并對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化和鑒定。純化后的重組hFSHR蛋白按所含的氨基酸分別記為F140和F240。 2.FSHR ECD B細(xì)胞表位的分析預(yù)測 采用DNAstar protein軟件，從二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、可及性、

7、可塑性和抗原指數(shù)等幾方面對(duì)FSHR ECD進(jìn)行分析；利用B細(xì)胞表位在線預(yù)測，從親水性、可及性、轉(zhuǎn)角、極性和抗原性等參數(shù)對(duì)胞外區(qū)進(jìn)行在線分析；以hFSH和FSHR相互作用復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)為初始模版(PDB ID:1xwd)，利用InsightⅡ分子模擬軟件包完成FSHR與FSH的分子對(duì)接。 3.FSHR B細(xì)胞表位融合肽的合成 為增強(qiáng)免疫原性，F(xiàn)SHR B細(xì)胞表位前接泛DR Th表位肽(PADRE)，融合肽送上海吉爾生化有

8、限公司合成。 4.B細(xì)胞表位肽疫苗的免疫效應(yīng) 采用重組hFSHR蛋白質(zhì)初次免疫、B細(xì)胞表位肽強(qiáng)化的免疫策略，與弗氏佐劑混合后免疫成年雄性B alb/C小鼠。初免后2周進(jìn)行強(qiáng)化免疫，每周強(qiáng)化一次，共3次。采用ELISA法檢測動(dòng)態(tài)監(jiān)測小鼠血清特異性IgG滴度變化。Westem blot法檢測小鼠血清與人睪丸蛋白的結(jié)合。在此基礎(chǔ)上，聯(lián)合Eppin優(yōu)勢B細(xì)胞表位免疫小鼠，ELISA法動(dòng)態(tài)監(jiān)測小鼠血清特異性IgG滴度變化。

9、 5.B細(xì)胞表位肽疫苗對(duì)生育力的抑制作用 末次免疫結(jié)束后2周和6周，分別將雄鼠與健康有生育力的雌鼠按1：3混合喂養(yǎng)2周，觀察雌鼠受孕率和每胎產(chǎn)仔數(shù)。 6.免疫小鼠的生殖內(nèi)分泌改變及機(jī)制研究 末次合籠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后2周，隨機(jī)處死小鼠，采集小鼠血清、睪丸、附睪。從精子計(jì)數(shù)、精子活力和精子尾部低滲膨脹實(shí)驗(yàn)(HOS)等方面對(duì)附睪精子進(jìn)行分析：從睪丸重量和睪丸精子2方面對(duì)睪丸進(jìn)行觀察；放免法測定小鼠血清睪酮(T)水平；聯(lián)合Ep

10、pin免疫組還觀察小鼠血清對(duì)正常人精子的抑制作用和檢測小鼠附睪沖洗液中IgA滴度。 7.免疫小鼠睪丸組織學(xué)檢查 處死小鼠分離睪丸組織固定，切片后行HE染色，觀察睪丸的組織學(xué)改變。 8.生育力恢復(fù)實(shí)驗(yàn) 小鼠初次免疫后40周(末次接種后36周)，ELISA檢測血清特異性抗體滴度降至1：5000以下，雄鼠與雌鼠按1：3混合喂養(yǎng)2周，觀察雌鼠受孕率和每胎產(chǎn)仔數(shù)。 結(jié)論： 1、通過PCR獲得了hFS

11、HR ECD和hEppin的DNA序列，成功地構(gòu)建了含有目的基因的原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。經(jīng)純化和復(fù)性后，重組蛋白的純度大于95010，具有較好的生物學(xué)特性。 2、利用DNAstar對(duì)hFSHR ECD二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，預(yù)測潛在的B細(xì)胞表位，結(jié)合B細(xì)胞表位在線預(yù)測和分子對(duì)接技術(shù)以提高預(yù)測的準(zhǔn)確性，綜合分析結(jié)果，最后選擇了4個(gè)候選B細(xì)胞表位肽。 3、為了增強(qiáng)B細(xì)胞表位肽的免疫原性，聯(lián)合候選肽與PADRE合成融合肽，合成

12、的肽純度均>85％。 4、采用FSHR蛋白初免、B細(xì)胞表位肽強(qiáng)化免疫的策略能有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的特異性抗體。FSHR的B細(xì)胞表位肽疫苗能通過減少精子數(shù)量而降低小鼠的生育力，但是伴有睪丸縮小、血睪酮降低和睪丸組織學(xué)改變的副作用； 5、聯(lián)合Eppin與FSHR免疫，在精子數(shù)量減少的同時(shí)，精子活力下降，導(dǎo)致小鼠的生育力進(jìn)一步下降，但是的副反應(yīng)并沒有進(jìn)一步加重。以后還需在疫苗劑型上深入研究以增強(qiáng)表位肽的免疫原性而降低甚至避免