附睪蛋白酶抑制蛋白的B細胞表位分析及抗生育效應(yīng)研究.pdf

1、世界人口持續(xù)增長的壓力和非計劃妊娠對生殖健康的危害使人們深刻認識到進一步完善避孕措施的迫切性。目前針對男性的避孕措施僅限于安全套和輸精管結(jié)扎，前者不夠方便，后者不可逆，因而遠遠不能滿足需求。開發(fā)更方便、高效、安全、可逆的男性避孕方法成為計劃生育研究的重要課題。迄今，男性避孕疫苗候選分子很多，但尚面臨避孕效果不理想以及T細胞介導(dǎo)的免疫損傷等局限。針對這兩個局限，設(shè)計新的疫苗形式和免疫策略實現(xiàn)突破，對開發(fā)安全、有效的避孕疫苗具有重要意義。

2、 附睪蛋白酶抑制蛋白(Epidydimal protease inhibitor，Eppin)基因的發(fā)現(xiàn)為男性避孕疫苗的開發(fā)帶來了曙光。Eppin蛋白特異表達于睪丸和附睪，在精子成熟中具有重要作用?？笶ppin抗體可直接破壞Eppin-精囊凝固蛋白(Semenogelin，Sg)復(fù)合體，干擾Eppin調(diào)控前列腺特異性抗原對Sg的水解作用，影響精子活動力，進而抑制生育力。利用重組Eppin蛋白免疫雄猴獲得了較理想的避孕效果(78％)

3、，停止免疫后，71％的受試雄猴恢復(fù)了生育力。由此可見，Eppin可望作為男性避孕的有效靶點，但仍需針對男性避孕疫苗存在的上述局限尋求突破。篩選獲得Eppin優(yōu)勢中和B細胞表位，并通過免疫小鼠研究其抗生育有效性和安全性是本研究的目的。 出于安全考慮，全長蛋白不適于用作疫苗，找出真正抑制生育的關(guān)鍵性表位并增強其免疫原性和避孕效果是關(guān)鍵。基于免疫學(xué)基本理論，我們設(shè)想，用全長Eppin蛋白免疫，將會產(chǎn)生針對其各個表位的記憶細胞克隆，當(dāng)只

4、用某個表位肽再次免疫時，則只有針對該表位的記憶細胞被激活、增殖進而分泌抗體。如果初次免疫采用重組人Eppin蛋白(recombinant human Eppin，thEppin)，加強免疫分別采用各候選表位肽，則可以通過所產(chǎn)生的抗體滴度高低來判斷該表位是否優(yōu)勢表位；而通過分析被免疫小鼠的生育力抑制效果及其抗血清對精子活力的體外抑制能力，則可判斷該表位是否中和性表位。因此，我們擬采用該策略來篩選Eppin的優(yōu)勢中和B細胞表位并研究其抗生育

5、潛能。 本研究首先通過RT-PCR法從人新鮮睪丸組織擴增獲得Eppin cDNA，構(gòu)建入原核表達載體，誘導(dǎo)表達并經(jīng)純化獲得重組人Eppin蛋白(第一部分)。同時，通過計算機軟件分析Eppin蛋白二級結(jié)構(gòu)及表面特性，預(yù)測出Eppin蛋白的B細胞表位所在區(qū)域；并通過與抗血清的結(jié)合試驗進行初步篩選，得出Eppin候選優(yōu)勢B細胞表位區(qū)段(第二部分)。最后，采用thEppin初次免疫，上述候選表位肽加強免疫的策略，觀察各個表位肽刺激抗體產(chǎn)

6、生、抗體對精子活力的抑制能力，以此進一步篩選出其優(yōu)勢中和B細胞表位，并以thEppin重復(fù)免疫為對照，分析其抗生育潛能及安全性(第三部分)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①通過分析Eppin蛋白二級結(jié)構(gòu)及表面特性(包括蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、親水性、可塑性、溶劑可及性及免疫原性等)，初步預(yù)測出Eppin蛋白的B細胞表位區(qū)域在第19～31、30～44、58～70、73～85、94～102、103～115、113～124、125～132區(qū)段：與抗血清的結(jié)合

7、試驗發(fā)現(xiàn)第58～70、19～31、103～115、113～124區(qū)域的抗原性相對較強，從而初步篩選得出了Eppin候選優(yōu)勢B細胞表位(前述四個肽分別命名為肽A～D)。②進一步采用thEppin初次免疫-候選表位肽加強免疫的篩選策略，發(fā)現(xiàn)用四個候選表位肽加強免疫時都能激發(fā)產(chǎn)生高滴度的抗體，并維持至8～9個月，而僅B肽、C肽和D肽加強免疫時所獲得的抗血清能與人精子天然Eppin蛋白結(jié)合，其中僅C肽加強免疫獲得的抗血清能顯著抑制人精子活力。從

8、而獲知Eppin優(yōu)勢中和B細胞表位所在區(qū)段為Eppir1103-115。③接受thEppin初次免疫—表位肽C加強免疫的雄鼠(EC組)，只能使26,6％的雌鼠受孕，與PBS組(88.9％)相比顯著降低，說明雄鼠的生育力受到抑制；而免疫8～9個月后，伴隨抗體滴度下降，該組雄鼠能使雌鼠的受孕率達80％，與PBS組(87％)無顯著差別，說明避孕作用具有可逆性。④接受thEppin重復(fù)免疫的雄鼠(Eppin組)，產(chǎn)生的抗體滴度雖略高于EC組，而

9、抗生育效果兩組相當(dāng)。Eppin組和EC組都只是顯著抑制了附睪精子的活力，而性激素水平、精子生成等均未受影響。各組織器官的病理檢查也未發(fā)現(xiàn)異常。但理論上，采用thEppin初次免疫—候選表位肽加強免疫策略，產(chǎn)生的抗體更多針對該表位肽，從而更具有安全性。 本研究結(jié)果表明計算機表位預(yù)測結(jié)合蛋白初免一表位肽加強免疫策略是篩選蛋白優(yōu)勢中和B細胞表位的有效方法和又一選擇；Eppin蛋白的第103-115區(qū)段是Eppin優(yōu)勢中和B細胞表位所在