灰飛虱免疫相關(guān)基因的克隆及其抗RSV免疫反應(yīng)的功能分析.pdf

1、灰飛虱（Laodelphax striatellus）能通過傳播水稻條紋葉枯病毒(Rice stripe virus，RSV)等病毒來危害水稻等植物，造成它們的嚴(yán)重減產(chǎn)。傳統(tǒng)的化學(xué)防治灰飛虱的方法效果逐漸不佳，不僅污染環(huán)境，還使其抗藥性加強，因此需要從新的方面探究防治技術(shù)，理解灰飛虱與RSV相互間的作用機制是關(guān)鍵。
　　昆蟲的先天免疫系統(tǒng)在抵御各種病原微生物方面起重要作用，各種病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）通過被各種特異性模式識

2、別受體(PRRs)識別而激活免疫反應(yīng)，肽聚糖識別蛋白(PGRPs)、革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白(GRPs)、Toll樣受體(TLRs)等都是PRR家族成員。為了了解灰飛虱的抗RSV機制，本論文首先以灰飛虱EST數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，采用RACE技術(shù)完成了灰飛虱八個免疫相關(guān)基因的克隆;利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了帶毒與無毒灰飛虱雌雄個體內(nèi)八個免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況，并進一步利用E.coli免疫刺激帶毒灰飛虱，重點分析免疫基因LsToll-8、LsTol

3、l-13、RSV-RNP的表達(dá)變化情況;最后，通過飼喂法RNAi技術(shù)初步分析了相應(yīng)免疫基因LsToll-13的功能，生物信息學(xué)方法進一步探究了了灰飛虱LsToll-13蛋白參與特異性識別水稻條紋葉枯病毒ssRNA的可能機制。實驗結(jié)果如下:
　　(1)利用RT-PCR和RACE-PCR技術(shù)克隆了8個灰飛虱免疫相關(guān)基因的全長cDNA的序列。包括2PGRPs、3GRPs、2TLRs、1Defensin B，分別命名為LsPGRP-LB、

4、LsPGRP-LC、LsGRP2、LsGRP4、LsGRP5、LsToll-8、LsToll-13、LsDefensin B，基因的克隆為基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　(2)利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了帶毒與無毒灰飛虱雌雄個體內(nèi)八個免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明不同基因在不同灰飛虱載體類型里均有表達(dá)，且表達(dá)量存在差異，以無毒灰飛虱為對照，LsGRP5、LsPGRP-LB、LsPGRP-LC在帶毒灰飛虱體內(nèi)表達(dá)量顯著上升，LsT

5、oll-8、LsToll-13、LsGRP2在帶毒灰飛虱體內(nèi)表達(dá)量顯著抑制。
　　(3)利用熒光定量PCR進一步檢測E.coli免疫刺激后帶毒灰飛虱LsToll-8、LsToll-13、RSV-RNP的表達(dá)變化情況，結(jié)果顯示在E.coli免疫刺激6h時，LsToll-13的表達(dá)水平顯著上調(diào)，RSV-RNP的表達(dá)量顯著下降，而LsToll-8的表達(dá)無顯著差異。
　　(4)通過飼喂法RNAi技術(shù)初步探究了5個免疫相關(guān)基因的功能，

6、結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有LsToll-13被干擾后，與對照組相比RSV-RNP的表達(dá)量顯著上升，此結(jié)果進一步證明了LsToll-13基因參與了灰飛虱抗RSV的免疫反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)方法把LsToll-13蛋白的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測出來，通過與鼠的TLR13蛋白二聚體復(fù)合物結(jié)構(gòu)整體比較初步闡明了灰飛虱LsToll-13蛋白參與特異性識別ssRNA的可能機制。
　　本論文首次在灰飛虱中克隆了八個免疫相關(guān)基因，為進一步研究灰飛虱抗病毒免疫反應(yīng)