擬南芥抗灰葡萄孢相關(guān)基因的克隆和功能分析.pdf

1、灰霉病是一種世界性的重要病害，病原為灰葡萄孢(Botrytiscinerea)，其寄主范圍廣，常造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。本論文在研究擬南芥不同生態(tài)型對不同病原菌抗性反應(yīng)的基礎(chǔ)上，探討了擬南芥抗灰葡萄孢侵染的表型特征、細(xì)胞學(xué)證據(jù)和生化機制，對擬南芥抗灰葡萄孢基因進行了連鎖分析和定位，應(yīng)用抑制性消減雜交(SSH)和mRNA差異顯示—PCR(DDRT-PCR)技術(shù)獲得了大量擬南芥抗灰葡萄孢的相關(guān)基因片段，克隆了2個擬南芥抗灰葡萄孢相關(guān)基因，同時通

2、過原核基因的表達初步驗證其中1個抗病相關(guān)基因?qū)移咸焰叩纳L有一定的抑制作用。為更好地利用模式植物擬南芥的遺傳資源和信息，促進植物抗病基因的克隆和相關(guān)作物的遺傳改良奠定了良好的基礎(chǔ)。 1.通過對擬南芥11個生態(tài)型對不同植物病原菌的抗病性反應(yīng)測定，篩選出了具有抗/感差異表現(xiàn)的擬南芥—病原菌組合。供試40個菌株中，有19個菌株對擬南芥的11個生態(tài)型都表現(xiàn)抗/感差異，其中10株為灰葡萄孢菌株。試驗選擇灰葡萄孢菌株BC18為供試菌株，確

3、定對其表現(xiàn)抗病的Col-0、Ws-0生態(tài)型和對其表現(xiàn)感病的Ler生態(tài)型為供試擬南芥。Col-0、Ws-0生態(tài)型接種灰葡萄孢菌株BC18后表現(xiàn)的抗病癥狀不同。Col-0生態(tài)型接種后表現(xiàn)免疫，Ws-0生態(tài)型接種后則出現(xiàn)過敏性壞死斑點。 2.試驗對3個擬南芥生態(tài)型的細(xì)胞組織形態(tài)進行顯微觀察，比較在3個擬南芥生態(tài)型的葉片上，病菌的萌發(fā)、侵入及擴展的情況，獲得了擬南芥Col-0和Ws-0生態(tài)型抗灰葡萄孢以及Ler生態(tài)型感灰葡萄孢的細(xì)胞學(xué)證

4、據(jù)。同時，試驗通過比較擬南芥抗病生態(tài)型Ws-0和感病生態(tài)型Ler接種灰葡萄孢后寄主防御酶系活性和非酶類物質(zhì)丙二醛的含量變化，探討了防御酶系和非酶類物質(zhì)與擬南芥抗灰葡萄孢侵染的關(guān)系。確定了POD、CAT、PPO和PAL活性及MDA含量與擬南芥對灰葡萄孢的抗性密切相關(guān)；SOD活性與擬南芥對灰葡萄孢的抗性關(guān)系不密切。 3.本研究將抗灰葡萄孢擬南芥生態(tài)型Col-0與感病生態(tài)型Ler進行雜交，分析F1和F2代對灰葡萄孢的抗病表現(xiàn)，確定了擬

5、南芥對灰葡萄孢的抗性受2個基因控制。應(yīng)用圖位克隆技術(shù)，確定了與2個抗病基因連鎖的分子標(biāo)記，將抗灰葡萄孢基因(暫命名為BC1和BC2)分別定位于擬南芥第4染色體和第5染色體上。BC1位于CCR1和DHS1之間，分別與CCR1和DHS1相距1.2cM和1.6cM；BC2位于CA72/NGA151和NGA106之間，分別與CA72/NGA151和NGA106相距1.4cM和2.4cM。 4.利用抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)，獲得擬南芥

6、不同生態(tài)型接種灰葡萄孢后基因表達的差異cDNA片段。同源性分析表明，接種灰葡萄孢后，誘導(dǎo)了一些與轉(zhuǎn)錄、膜內(nèi)外物質(zhì)轉(zhuǎn)移、蛋白合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)的基因表達，并有可能啟動多種調(diào)控機制，尤其是轉(zhuǎn)錄過程中的調(diào)控。片段AM-2含有GAF保守區(qū)域，與組氨酸激酶傳感器有較高的同源性，與擬南芥的乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，因此初步判斷AM-2序列可能與擬南芥的誘導(dǎo)抗病性有關(guān)。 5.利用mRNA差異顯示—PCR(DDRT-PCR)差異顯示技術(shù)，獲得49條擬

7、南芥不同生態(tài)型接種灰葡萄孢后基因表達的差異片段。選取11個差異片段進行克隆、測序，同源性分析表明，片段A33-2與擬南芥的第5條染色體基因組DNA的TAC克隆K9I9和轉(zhuǎn)錄結(jié)合/調(diào)節(jié)蛋白AT5G67480的同源性達到98﹪-99﹪；片段A33-3與擬南芥Col-0生態(tài)型NADH-脫氫酶的亞基4L同源性為98﹪；片段M7-1與擬南芥Col-0生態(tài)型的類似磷酸甘油酯轉(zhuǎn)移家族蛋白的同源性達到96﹪；片段J7-1、J49-1、M32-1、M33

8、-1、M35-1和M50-1與已知的蛋白序列同源性較低。片段J16-1和A25-3與已知蛋白序列沒有同源性，可能為新基因。片段A33-2、A33-3、J49-1和J7-1是灰葡萄孢侵染后抗病生態(tài)型中誘導(dǎo)表達的，M7-1是感病生態(tài)型中受抑制不表達的，所以初步判斷A33-2、A33-3、J49-1、J7-1和M7-1為抗病相關(guān)基因片段。 6.利用RACE技術(shù)獲得了抗灰葡萄孢相關(guān)基因片段A33-2的全長cDNA序列。該序列包含1個長度

9、為1119bp的開放閱讀框，編碼含有372個氨基酸的蛋白。蛋白的分子量為12.50401kD，等電點為4.75。Southern雜交結(jié)果表明，該基因為單拷貝，位于擬南芥Col-0生態(tài)型第5條染色體26948165-26950151bp處。同源性分析表明，該基因是編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)/結(jié)合蛋白的AT5G67480基因。AT5G67480基因全長為1987bp，包含4個內(nèi)含子。該基因有2種基因模式，即：AT5G67480.1和AT5G67480.2

10、，其中AT5G67480.1為AT5G67480基因的典型基因模式。該基因編碼蛋白中含有TAZ鋅指家族蛋白BTB/POZ結(jié)構(gòu)域。對該基因進行原核表達，將誘導(dǎo)表達蛋白進行體外抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)該基因表達的蛋白對灰葡萄孢的生長有一定的抑制作用。同時，利用RACE技術(shù)獲得了抗病相關(guān)基因片段A33-3的側(cè)翼序列，獲得1個完整的讀碼框。同源性分析表明，該ORF為編碼NADH脫氫酶亞基4L(NADHdehydrogenasesubunit4L)的NAD