表皮松解性掌跖角化癥基因型--表型相關性分析、產前基因診斷及基因突變敲入小鼠模型的構建.pdf

1、第一部分表皮松解性掌跖角化癥基因型-表型相關性分析及產前基因診斷
　　背景:表皮松解性掌跖角化癥(epidermolytic palmoplantar keratoderma，EPPK。OMIM:144200)是相對常見的致殘性常染色體顯性遺傳性皮膚病。角蛋白9基因(KRT9)為EPPK的主要致病基因，外顯率100％。
　　目的:繪制本研究所收集到的EPPK家系基因突變譜，分析EPPK表型與致病基因KRT9基因型之間的相關性

2、。根據患者的需要，在致病突變明確后進行產前基因診斷。
　　方法:收集了12個漢族EPPK家系，采集外周血樣本，利用PCR-DNA測序、AS-PCR、DHPLC及RFLP確定和驗證相關KRT9基因和KRT1基因突變類型。繼而，對4個家系的高風險患病胎兒進行了產前基因診斷。
　　結果:(1)在本研究所涉及的11個EPPK家系或散發(fā)病例中存在5種KRT9雜合突變，分別為c.C487T（p.Arg163Trp）、c.T470C（p.

3、Met157Trp）、c.T1373C(p.Leu.458Pro)、c.G488A(p.Arg163 Gln)、c.A482G(p.Asn161Ser)，并且c.C487T（p.Arg163Trp）為發(fā)生頻率最高的突變型，占41.7％(5/12);一個EPPK家系患者未發(fā)現任何KRT9或KRT1基因突變;(2)除了典型的掌跖部表皮彌漫性增厚外67％(8/12)，EPPK家系患者還存在指節(jié)墊表型，且大部分患者形成的指節(jié)墊與外力摩擦無關聯(lián)，

4、提示指節(jié)墊可能是KRT9突變引起的另一個原發(fā)癥狀;3個家系的部分患者還伴發(fā)先天性指屈曲表型，其KRT9突變?yōu)閜.Asn161Ser和p.Leu458Pro，推測先天性指屈曲還可能與環(huán)境因素有關;(3)利用羊水DNA-PCR-Sanger測序的方法，成功地完成了4例產前基因診斷，其中3例為正常胎兒，1例為致病突變攜帶胎兒。
　　結論:KRT9突變基因型和EPPK表型之間存在復雜的相關性，遺傳異質性可能受環(huán)境因素、多態(tài)性核苷酸位點或修

5、飾基因等未知因素的影響。指節(jié)墊可能為KRT9突變引起的另一個原發(fā)癥狀，而先天性指屈曲的形成可能受環(huán)境因素影響較大。開展基于KRT9基因突變檢測的產前DNA診斷對于EPPK的預防非常關鍵。
　　第二部分表皮松解性掌跖角化癥KRT9基因突變敲入小鼠模型的構建
　　背景:建立EPPK的動物模型，不僅可為探討疾病發(fā)生的分子和細胞生物學機制提供線索，而且可以作為一種理想的活體用于疾病的基因治療、新藥研發(fā)等諸多研究。
　　目的:為

6、了更好地在成體和細胞水平上了解EPPK的發(fā)生發(fā)展和K9蛋白的功能，為EPPK的后續(xù)基因治療和臨床用藥治療等研究奠定堅實的理論及實踐基礎。
　　方法:通過構建與EPPK患者KRT9突變c.500delAinsGGCT同源性的小鼠Krt9基因c.434delAinsGGCT突變載體，利用同源重組原理基因打靶小鼠胚胎干細胞-囊胚注射后，移植到假孕鼠子宮獲得嵌合鼠的出生。通過嵌合鼠與野生型母鼠的配繁，篩選得到穩(wěn)定遺傳的Krt9基因突變敲入

7、小鼠。通過表型分析、組織學檢測、蛋白印跡實驗和免疫組化分析等系統(tǒng)評估小鼠的表型，初步探討EPPK發(fā)病的分子機制。
　　結果:(1) Krt9/c.434delAinsGGCT雜合突變小鼠在出生后3～4周即出現前、后爪足墊區(qū)皮膚黑色過度角化斑，且隨著時間的推移更加趨向明顯。表型出現增厚-蛻皮-增厚的變化，周期為3周左右;(2)石蠟切片H&E染色結果顯示，突變小鼠足墊區(qū)皮膚角質層增厚，棘層、顆粒層細胞增多和空泡樣改變。掃描電鏡分析顯示

8、，突變小鼠足墊區(qū)皮膚出現破裂松解性改變，透射電鏡觀察到在棘層、顆粒層細胞中存在空泡樣改變和黑色異常蛋白聚集顆粒物的出現;(3)蛋白表達分析結果顯示，在突變小鼠足墊區(qū)表皮中出現K5、K2蛋白表達量的下調，K10、K6和K16蛋白表達量的上調;(4)免疫組化分析結果顯示，絲聚合蛋白和外披蛋白的表達量增加;Ki-67和p63蛋白表達量和分布發(fā)生改變。
　　結論:Krt9/c.434delAinsGGCT突變敲入小鼠在遺傳方式和表型上都高

9、度模擬人EPPK的發(fā)生、發(fā)展，為理想的疾病模型。突變的K9蛋白可能阻礙了正常K9/K1二聚體的形成，從而導致作為小鼠機械承受力最大的足墊區(qū)表皮細胞骨架的崩塌，K2角蛋白的減少和抗壓能力較弱的其他角蛋白——K10、K6和K16代償性地表達增高，可能使得上基底層細胞發(fā)生細胞溶解。而基底細胞的過度增殖使得棘層、顆粒層細胞數量增多和不規(guī)整排列，可能最終導致了Krt9/c.434delAinsGGCT突變小鼠出現EPPK相似的角化過度和皮膚松解癥