HCV的抗體依賴性感染增強的體外實驗研究.pdf

1、為探討HCV母嬰傳播過程中的可能存在的ADE機制,我們進行了如下工作:一、改良法分離滋養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)及鑒定胎盤滋養(yǎng)層細胞的分離培養(yǎng):滋養(yǎng)層細胞的分離培養(yǎng)實驗參照國內外相關文獻并加以改進,采用胰蛋白酶消化法消化人足月胎盤絨毛組織,制成單細胞懸液,以35％及45%兩層Percoll密度梯度分離純化單細胞懸液,以得到滋養(yǎng)層細胞進行體外培養(yǎng).經免疫組化染色及透射電鏡觀察證實,改良后的分離純化方法得3到了較高純度的滋養(yǎng)層細胞,胞漿中表達角蛋白、C

2、D16,而無波形蛋白表達,為進一步探討HCV母嬰傳播的機制奠定了細胞學實驗基礎.二、滋養(yǎng)層細胞體外感染HCV的免疫電鏡觀察將HCV RNA陽性血清與培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細胞共同孵育,以HCV包膜蛋白為抗原,SPA-膠體金作為標記物,進行免疫電鏡檢測,發(fā)現了滋養(yǎng)層細胞內被標記的HCV病毒顆粒,大小形態(tài)與現有文獻報道相符.可見程度不重的細胞器改變,主要超微結構改變?yōu)檩p度腫脹,胞質密度降低,細胞器減少等;滑面內質網增生,呈囊泡狀、管狀及合狀聚集.實驗

3、為HCV經ADE進入滋養(yǎng)層細胞提供理論依據,為HCV母嬰傳播途徑提供了直接的形態(tài)學支持.三、滋養(yǎng)層細胞Fc γ RⅢ介導HCV感染的跨膜轉運研究以不同方式處理的HCV RNA陽性血清對培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細胞進行體外感染試驗,以定性RT-PCR法檢測感染后21d內細胞內和培養(yǎng)上清中HCV RNA正負鏈,同時以免疫組化方法檢測各組細胞內HCV NS5表達.HCV RNA正鏈在對照組、血清補體滅活組、CD16 McAb組均未檢測到,全血清組細胞內外

4、可以間斷測得;HCV RNA負鏈僅在全血清組細胞內間斷測到.感染6d后檢測胞漿內HCV表達的NS5、NS3、C區(qū)抗原,也僅在全血清組中發(fā)現.HCV RNA負鏈及HCV多抗原在全血清組的短期檢出,表明HCV可以在滋養(yǎng)層細胞中復制,但持續(xù)時間有限,ADE機制在其中可能起作用.該實驗結果首次證實,HCV感染滋養(yǎng)層細胞的過程中存在ADE機制.感染時缺乏補體或使用CD16 McAb,明顯影響HCV進入滋養(yǎng)層細胞,提示抗體和補體均參與了HCV的跨膜