豬IgG Fc受體及其介導PRRSV抗體依賴增強作用研究.pdf

1、Fc受體（FcR）為特異親和免疫球蛋白（Ig）Fc片段的細胞表面分子，廣泛表達于免疫細胞表面，具有許多重要的生理功能，是體液免疫與細胞免疫的聯(lián)系紐帶，在機體免疫調(diào)控中起關鍵作用。目前人和小鼠的三類IgG Fc受體（FcγRⅠ、FcγRⅡ和FcγⅢ）研究最為深入。本研究克隆和鑒定了豬IgG三類Fc受體；研究了PRRSV變異毒株和經(jīng)典毒株感染后活化性Fc受體和抑制性Fc受體的轉錄動態(tài)差異及與免疫抑制的關系；構建了穩(wěn)定表達豬FcγRⅡ的Mar

2、c-145細胞系，研究了該受體在介導PRRSV ADE中的重要作用。 用人CD64氨基酸序列檢索NCBI的EST數(shù)據(jù)庫（包括除人和老鼠以外的所有物種核苷酸序列）（tBLASTn），發(fā)現(xiàn)了6個豬的高同源overlapping序列，利用這些序列信息設計引物，采用RT-PCR從豬外周血白細胞中擴增到了豬FcγRⅠ cDNA序列，命名為poFcγRⅠ。poFcγRⅠ ORF全長1038 bp，編碼346氨基酸的糖蛋白。胞外區(qū)包括二個Ig

3、樣結構，有4個N-糖基化位點。poFcγR≧和人、牛與老鼠的FcγRⅠ在氨基酸水平上分別有79％、69％和57％的相似性。胞外環(huán)區(qū)相似性較高，分別為77％、74％和70％，這提示人、牛、豬、鼠的FcγRⅠ和IgG的結合域高度保守。隨后，RT-PCR檢測到了poFcγRⅠ mRNA在巨噬細胞、單核細胞中表達量較高，在多形核細胞中也有表達，在淋巴細胞中沒有表達，和人與小鼠CD64的表達譜類似。將poFcγRⅠ ORF基因亞克隆到真核表達載體

4、pcDNA構建成重組質(zhì)粒pcDNA/poFcγRⅠ，再用脂質(zhì)體法轉染COS-7細胞，用玫瑰花環(huán)實驗鑒定了poFcγRⅠ配體親和特性。 對豬IgG Fc受體的進一步研究發(fā)現(xiàn)豬IgG Fc受體共由三類分子組成，即FcγRⅠ、FcγRⅡ和FcγⅢ，克隆了這二類受體cDNA，其中FcγRⅡ胞內(nèi)區(qū)有保守的ITIM基序，為抑制性受體；FcγRⅠ和FcγRⅢ胞內(nèi)區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)已知的信號傳導基序，通過γ鏈的ITAM基序進行信號轉導，因而這兩個受體為

5、活化性受體。發(fā)現(xiàn)FcγRⅡ至少存在兩個亞類，即FcγRⅡB1和FcγRⅡB2，F(xiàn)cγRⅡB1胞內(nèi)區(qū)有一插入序列，使胞內(nèi)區(qū)由47個氨基酸延長到99個氨基酸。這兩個亞類胞內(nèi)區(qū)均存在ITIM基序，因此均為抑制性受體。 活化型受體和抑制型受體共表達于免疫細胞表面，共同調(diào)節(jié)抗體對免疫細胞的活化作用。抗原抗體復合物和免疫細胞表面的活化型受體給合，能活化免疫效應細胞，誘發(fā)多種免疫學效應。抑制型受體的作用剛好相反，通過免疫復合物與抑制型受體交聯(lián)

6、，抑制活化受體介導的細胞活化。研究PRRSV感染后活化型和抑制型Fc受體的轉錄動態(tài)，對于揭示PRRSV感染引起的免疫抑制有重要意義。通過Real-time PCR檢測不同毒株PRRSV感染后豬體活化性和抑制性Fc受體的轉錄動態(tài)，發(fā)現(xiàn)PRRSV感染后活化性受體FcγRⅠ和FcγRⅢ均迅速下調(diào)，而抑制性Fc受體FcγRⅡ感染后有輕微上調(diào)。PRRSV感染后機體能夠快速誘導產(chǎn)生高水平的特異性抗體，但感染后活化性Fc受體下調(diào)導致抗體和抗原抗體復合

7、物不能活化免疫效應細胞，從而引起細胞免疫功能下降，這是PRRSV感染引起免疫抑制的分子基礎。 抗體依賴增強作用（ADE）是PRRS防控中遇劍的最大的難題之一。本研究將豬FcγRⅡ基因轉染Marc-145細胞，通過G418連續(xù)篩選和克隆獲得了穩(wěn)定表達豬FcγRⅡ的Marc-145細胞系。用PRRSV BJ-4株與1：320稀釋的抗PRRSV IgG感染克隆化的Marc-145細胞系，在有抗體存在的情況下PRRSV感染收獲的病毒量明