Hedgehog通路SMO抗體的制備及其對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌作用的研究.pdf

1、背景:
　　 前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。早期局限性前列腺癌可行根治性手術(shù)或放療,治愈率高。然而對(duì)于轉(zhuǎn)移性前列腺癌,內(nèi)分泌治療雖然初期有一定作用,可是,幾乎所有病變會(huì)最終發(fā)展為激素非依賴性前列腺癌,尚無(wú)有效的治療方法。近期,以多西紫杉醇為基礎(chǔ)的化療方案經(jīng)臨床試驗(yàn)證明可以提高激素非依賴性前列腺癌患者的生存率,改善生活質(zhì)量。不過(guò),副作用較大,且藥物作用有限,需要尋找新型的治療激素非依賴性前列腺癌的策略和藥物。

2、r>　　 Hedgehog(Hh)信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物中廣泛存在,參與胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育和器官形成。該通路同樣在前列腺的發(fā)育中起作用,而且,有證據(jù)顯示,前列腺癌可表達(dá)該通路的靶基因PTCH1和GLI1;在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),該通路抑制劑環(huán)耙明能抑制前列腺癌腫瘤生長(zhǎng)、改變侵襲能力,表明該通路不適當(dāng)?shù)募せ钆c前列腺癌的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。然而,Hh通路在前列腺癌中的作用方式不能明確,存在自分泌和旁分泌之爭(zhēng)。此外,有關(guān)研究也提示

3、了環(huán)耙明作用特異性的可疑,表明環(huán)耙明對(duì)前列腺癌細(xì)胞的抑制可能是不依賴Hh通路的,具有脫靶效應(yīng)。
　　 和化學(xué)合成的小分子藥物相比,抗體對(duì)相應(yīng)抗原具有高特異性和高親和力的靶向結(jié)合能力。SMO蛋白是Hh信號(hào)通路中關(guān)鍵的受體蛋白。本實(shí)驗(yàn)擬制備出抗SMO抗體,將其應(yīng)用于激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞DU145,觀察其變化,一方面為自分泌或旁分泌方式提供證據(jù),另一方面,判斷該抗體能否應(yīng)用于激素非依賴性前列腺癌的治療。
　　 方法和結(jié)果:

4、
　　 首先,對(duì)SMO蛋白進(jìn)行抗原表位預(yù)測(cè),然后合成多肽,與鑰孔血藍(lán)蛋白偶聯(lián)后對(duì)新西蘭兔進(jìn)行免疫。第四次免疫后取血清,ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)為1∶240,000。抗血清經(jīng)抗原親和純化后進(jìn)行Westernblot免疫印跡檢測(cè),結(jié)果顯示,抗血清可特異性結(jié)合DU145細(xì)胞中SMO蛋白,表明成功制備了抗SMO多克隆抗體。
　　 其次,用MTT實(shí)驗(yàn)判斷抗SMO抗體對(duì)DU145細(xì)胞增殖的影響,用流式細(xì)胞儀觀察其誘導(dǎo)DU145凋亡情

5、況,用小室試驗(yàn)檢測(cè)抗體對(duì)DU145細(xì)胞侵襲力的改變狀況,并行RT-PCR,依據(jù)PTCH1和GLI1mRNA表達(dá)水平判斷Hh信號(hào)通路在DU145細(xì)胞中的狀態(tài),同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和正常兔IgG對(duì)照。結(jié)果表明,在DU145細(xì)胞存在自分泌的Hh信號(hào)通路,抗SMO抗體可特異性地阻斷Hh信號(hào)通路,抑制DU145細(xì)胞的增殖,并誘導(dǎo)其凋亡,降低侵襲力。
　　 最后,聯(lián)合應(yīng)用抗SMO抗體和多西紫杉醇于DU145細(xì)胞,并使用同樣的實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線。結(jié)果表