中藥單體化合物Lariciresinol對樹突狀細胞功能的調控作用及其機制研究.pdf

1、免疫抑制劑具有重要的臨床應用價值，廣泛應用于器官移植抗排斥反應和自身免疫性疾病的治療，常見的免疫抑制劑有糖皮質激素、維生素D3、環(huán)孢素A、雷帕霉素、它克莫司等。這些免疫抑制劑在臨床應用的過程中，在產生治療效應的同時，也具有一定的副作用，因此，研發(fā)新的具有治療作用的免疫抑制劑意義重大。作為我國傳統醫(yī)學中的瑰寶，中草藥對疾病的預防和治療作用，尤其是對炎癥、感染、腫瘤、自身免疫、移植排斥等疾病的預防和治療作用，主要是通過免疫系統實現的。中藥中

2、很可能存在具有免疫抑制作用的成分，發(fā)現這些成分并研究其功能具有理論和應用價值。由于樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)是機體免疫應答中的關鍵細胞，該類細胞也很可能是免疫抑制劑的主要的靶細胞，因此，以DCs作為靶細胞很可能篩選到具有抑制作用的中藥成分。鑒于此，我們課題組與第二軍醫(yī)大學藥學院張衛(wèi)東教授課題組合作，利用基于DCs分化發(fā)育和功能成熟的藥物篩選平臺，從496種中藥單體化合物中成功篩選出18類31個有效單體成分。并選

3、擇對DCs分化發(fā)育抑制率較高，而本身的細胞毒性較小，且能有效促進DCs分泌IL-10的免疫抑制性的絲毛瑞香的提取物Lariciresinol(分子式C20H21O6)作為研究對象，深入研究該成分對DCs的調控及其機制；并使用過敏性自身免疫反應性腦脊髓膜炎(EAE)模型研究了其在體內應用的有效性。
　　 (一)中藥單體化合物Lariciresinol對DCs功能的影響
　　 以本身的細胞毒性較小，且能有效促進DCs分泌IL

4、-10的Lariciresinol成分為研究對象，研究了Lariciresinol對DCs的凋亡誘導作用、對DCs吞噬功能、成熟表型、細胞因子分泌、激發(fā)同種異體免疫反應和抗原提呈能力的影響。我們以GM-CSF和IL-4誘導小鼠骨髓細胞生成DCs，并使用藥物處理第五天的未成熟DCs24小時，再用終濃度為100ng/ml的LPS刺激24小時，檢測相應指標。使用FACS檢測annexin V和PI的方法確定了16nmol/ml為Laricir

5、esinol對未成熟DCs的無毒性濃度范圍。后期的研究發(fā)現，Lariciresinol不能影響DCs的吞噬和分泌IL-12P70、TNF-α和TGF-β的能力，卻能明顯促進抑制性細胞因子IL-10的分泌，并能抑制DCs激發(fā)同種異體免疫反應(MLR)和特異性抗原提呈能力。
　　 (二)中藥單體化合物Lariciresinol促進DCs分泌IL-10的機制研究
　　 IL-10是一種重要的具有免疫負調節(jié)作用的細胞因子。Lar

6、iciresinol是如何促進IL-10分泌的呢?進一步實驗發(fā)現，Lariciresinol對DCs分泌IL-10的促進具有Lariciresinol濃度梯度依賴性和LPS的濃度梯度依賴性。那么，促進的信號通路如何呢?我們采用Western Blot技術，Lariciresinol處理第五天的未成熟DCs24小時，再加入終濃度為100ng/ml的LPS，并在第0、15、30和60分鐘，裂解細胞，收集蛋白檢測ERK1/2、p38和JNK的

7、磷酸化情況，發(fā)現Lariciresinol能夠明顯增強ERK1/2的磷酸化；ERK1/2信號通路抑制劑PD98059能夠抑制Lariciresinol對DCs的IL-10分泌促進作用，另外，p38信號通路抑制劑SB203580，亦能抑制Lariciresinol促進的IL-10分泌作用。由此，證明了Lariciresinol通過ERK1/2信號通路促進DCsIL-10的分泌，而對P38信號可能具有基礎性的活化作用。
　　 (三)

8、中藥單體化合物Lariciresinol處理的DCs過繼轉移和Lariciresinol體內注射均能抑制自身免疫病的發(fā)生
　　 既然，Lariciresinol可以明顯促進DCs分泌IL-10的能力，并能部分抑制DCs的成熟和抗原提呈能力，那么，Lariciresinol處理的DCs能否通過誘導免疫耐受而抑制自身免疫病的發(fā)生呢?Lariciresinol直接體內注射，又如何呢?本部分研究中，我們通過小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎(

9、EAE)模型，對其抑制作用進行了研究。
　　 以MOG35-55多肽作為抗原，輔以腹腔注射百日咳毒素，成功地建立C57BL/6小鼠的EAE模型。其中抗原肽誘導建立的EAE組小鼠發(fā)病率達到95％，平均臨床打分為3.16±0.79，并且該EAE模型為復發(fā)-緩解型，在疾病過程中具有間歇期和不同程度的恢復。隨后我們觀察了Lariciresinol處理的DCs對EAE誘導的保護效果。取培養(yǎng)至第五天的骨髓細胞來源的未成熟樹突狀細胞，8nmo

10、l/ml Lariciresinol處理24小時，用LPS刺激活化18小時后負載髓鞘少突膠質細胞糖蛋白MOG35-55抗原肽，通過腹腔注射免疫正常C57BL/6小鼠，免疫后第二天在各組小鼠中誘導EAE。我們發(fā)現與對照組小鼠相比，Lariciresinol處理的DCs組小鼠的發(fā)病時間明顯推遲；發(fā)病率也明顯下降；此外，與對照組比較，臨床神經功能評分也有所改善。以上結果都顯示，Lariciresinol處理的DCs能使EAE誘導的發(fā)病時間推遲

11、，降低小鼠的發(fā)病幾率，改善小鼠的臨床癥狀，對MOG35-55抗原肽誘導的EAE具有保護作用。為了進一步從體內驗證Lariciresinol的直接作用，我們腹腔內直接注射Lariciresinol一周后，直接誘導EAE發(fā)病，結果發(fā)現Lariciresinol直接注射對EAE的抑制作用更明顯。
　　 綜上所述，我們對Lariciresinol對DCs免疫功能的調節(jié)及其機制進行了研究。發(fā)現Lariciresinol通過ERKI/2和P