轉(zhuǎn)錄因子SOX2促進人喉癌上皮細(xì)胞Hep-2惡性表型的機制及相關(guān)信號通路研究.pdf

1、前言：
　　喉癌是頭頸部常見癌癥之一，喉癌的預(yù)后給患者帶來了極大的痛苦。喉鱗狀細(xì)胞癌是一種最常見的喉癌類型，極易發(fā)生頸部的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。研究報道，干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子SOX2的表達(dá)異常參與多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展進程。在對喉癌患者的喉癌組織研究中證實SOX2的高表達(dá)促進喉癌的發(fā)生和發(fā)展進程，但目前SOX2在該過程中發(fā)生作用的具體分子機制仍然不清楚，有待于進一步深入研究。
　　基于癌細(xì)胞無限增殖、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移的特點，給癌癥的治愈帶來很大

2、的難度。腫瘤的轉(zhuǎn)移是引起腫瘤的發(fā)病率和死亡率重要原因。研究證明SOX2參與多種腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，但卻發(fā)揮雙重作用。在胃癌和肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，SOX2的高表達(dá)降低了兩種癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力;然而在乳腺癌和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中，SOX2的高表達(dá)卻發(fā)揮了相反的作用。目前還未見高表達(dá)SOX2對喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響的報道。研究證實MMP-2在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，高表達(dá)SOX2后是否會影響MMP-2的表達(dá)和活性，進而影響

3、喉癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，仍需進一步研究以闡明高表達(dá)SOX2對喉癌細(xì)胞增殖和遷移的作用機制。
　　研究表明，PI3K/AKT信號通路參與人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，該通路與腫瘤的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲等多個細(xì)胞過程有關(guān)。PI3K-AKT信號通路成為鼻咽癌、胰腺癌、甲狀腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌和乳腺癌等多種癌癥治療的靶點。研究表明PI3K/AKT信號通路的異?；罨c喉鱗癌的發(fā)生有關(guān)。在人前列腺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路參與SOX2

4、的表達(dá)。而且研究發(fā)現(xiàn)有藥物可以通過PI3K/AKT途徑抑制Hep-2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。但在Hep-2細(xì)胞中，SOX2是否通過PI3K/AKT途徑介導(dǎo)細(xì)胞的增殖和遷移，未見報道。
　　本實驗分為三部分，首先通過分子生物學(xué)手段構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SOX2，通過脂質(zhì)體2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到喉癌細(xì)胞Hep-2中，構(gòu)建SOX2基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，為研究SOX2基因在喉癌中的作用建立良好的實驗平臺。然后對Hep-2細(xì)胞過表達(dá)S

5、OX2對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響進行研究。同時檢測了喉癌細(xì)胞SOX2過表達(dá)后對MMP-2的表達(dá)和活性影響，并通過siRNA干擾下調(diào)MMP-2表達(dá)和MMP-2抗體處理SOX2過表達(dá)Hep-2細(xì)胞，進一步驗證了MMP-2與細(xì)胞遷移和侵襲能力的關(guān)系，明確了SOX2高表達(dá)促進細(xì)胞遷移和侵襲的作用機制。最后，用PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002處理SOX2過表達(dá)細(xì)胞，檢測SOX2過表達(dá)對Akt，p-Akt，mTOR和p-mTOR在

6、細(xì)胞中表達(dá)的影響，Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力的變化。最終明確SOX2在喉癌細(xì)胞Hep-2中是否通過PI3K/Akt信號通路促進細(xì)胞的遷移和侵襲，為治療和預(yù)防喉癌的轉(zhuǎn)移和侵襲發(fā)現(xiàn)了新的靶點，并提供理論依據(jù)。
　　一、SOX2基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染喉癌細(xì)胞株(Hep-2)的建立
　　目的：構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SOX2，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法構(gòu)建SOX2過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)Hep-2細(xì)胞系，為研究SOX2在喉癌發(fā)生的機制及信號通路研究構(gòu)建良好

7、的實驗平臺。方法：PCR進行SOX2基因擴增，TA克隆和測序后獲得SOX2基因片段，雙酶切、連接和轉(zhuǎn)化后，挑取白色單菌落進行PCR菌落初步鑒定，用酶切反應(yīng)進一步鑒定，最終通過測序確定重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SOX2構(gòu)建正確。調(diào)整Hep-2細(xì)胞狀態(tài)，通過脂質(zhì)體2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Hep-2中，實驗分為細(xì)胞分為空白對照組(Hep-2)、空載體對照組(vector)和SOX2過表達(dá)組(SOX2)。使用600 g/mlG418的DMEM完全培

8、養(yǎng)基進行單克隆細(xì)胞株的篩選。篩選后的單克隆細(xì)胞置于37℃、5％CO2、飽和濕度條件下中進行培養(yǎng)，用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，初步鑒定SOX2過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)Hep-2細(xì)胞系是否構(gòu)建成功。通過Real-time PCR、Western blot和免疫熒光實驗從不同角度共同驗證各組細(xì)胞SOX2的表達(dá)情況。結(jié)果：成功的構(gòu)建了重組表達(dá)載體pEGFP-N1-SOX2。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)。通過Real-time

9、PCR、Western blot和免疫熒光實驗檢測結(jié)果顯示，對照Hep-2組，vector組細(xì)胞SOX2表達(dá)與前者表達(dá)變化不大，SOX2組細(xì)胞SOX2在mRNA和蛋白水平顯著表達(dá)(p＜0.01)。結(jié)論：成功的構(gòu)建了過表達(dá)SOX2基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染喉癌Hep-2細(xì)胞株。
　　二、過表達(dá)SOX2對喉癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響
　　目的：研究SOX2過表達(dá)后，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的變化以及對侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2的表達(dá)和

10、活性的影響，明確過表達(dá)SOX2影響細(xì)胞增殖和遷移能力的機制。方法：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，實驗分為空白對照組（Hep-2）、空載體對照組(vector)和SOX2過表達(dá)組(SOX2)?？寺⌒纬蓪嶒灆z測各組細(xì)胞克隆形成率，MTT實驗檢測各組細(xì)胞增殖情況，Western blot檢測增殖相關(guān)蛋白PCNA和Cyclin D1的表達(dá)。通過劃痕實驗檢測各組細(xì)胞的遷移能力，Transwell實驗檢測各組細(xì)胞的侵襲能力。Real-time PCR和Wester

11、n blot檢測各組細(xì)胞MMP-2的表達(dá)，明膠酶譜法檢測各組細(xì)胞MMP-2的活性。通過siRNA使SOX2過表達(dá)細(xì)胞MMP-2的表達(dá)下調(diào)，實驗分為空白對照組(SOX2)、陰性對照組(control siRNA)和MMP-2沉默組(MMP-2 siRNA)。Western blot檢測各組細(xì)胞MMP-2的表達(dá)，劃痕實驗檢測細(xì)胞的遷移能力，Transwell實驗細(xì)胞的侵襲能力。利用0.1μg/mlanti-MMP-2抗體和IgG抗體處理SO

12、X2過表達(dá)細(xì)胞，實驗分為空白對照組(SOX2)、IgG對照組(IgG)和anti-MMP-2組(anti-MMP-2)。劃痕實驗檢測藥物處理各組細(xì)胞12h和24 h的遷移能力，Transwell實驗檢測藥物作用各組細(xì)胞24 h的侵襲能力。結(jié)果：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，與Hep-2組相比，SOX2組細(xì)胞克隆形成率、細(xì)胞增殖率、PCNA和Cyclin D1的表達(dá)水平、細(xì)胞遷移率和細(xì)胞侵襲個數(shù)顯著提高(P＜0.01)，而vector組與對照組各指標(biāo)差

13、異不大。相對Hep-2組，SOX2過表達(dá)后通過Real-time PCR和Western blot檢測細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.01），明膠酶譜法發(fā)現(xiàn)MMP-2的活性顯著提高（P＜0.01）。無論是RNAi使過表達(dá)SOX2細(xì)胞中MMP-2表達(dá)下調(diào)還是使用anti-MMP-2處理SOX2過表達(dá)細(xì)胞，相對于SOX2組，細(xì)胞的遷移和侵襲能力均下調(diào)。結(jié)論：SOX2過表達(dá)后促進Hep-2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，同時伴隨著MM

14、P-2表達(dá)的上調(diào)和活性的增加。揭示SOX2可能通過介導(dǎo)MMP-2的表達(dá)影響細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　三、過表達(dá)SOX2對喉癌細(xì)胞中PI3K-Akt信號通路的影響
　　目的：通過Western blot檢測PI3K/AKT信號通路特異性抑制劑LY294002處理pEGFP-N1-SOX2細(xì)胞后Akt，p-Akt，mTOR和p-mTOR的表達(dá)情況，Transwell檢測LY294002處理后對SOX2過表達(dá)細(xì)胞的侵襲能力的影響

15、，明確Hep-2細(xì)胞SOX2過表達(dá)后是否介導(dǎo)PI3K-AKT信號通路促進細(xì)胞惡性表型的發(fā)生。方法：用20μM的LY294002和DMSO分別處理pEGFP-N1-vector和pEGFP-N1-SOX2兩組細(xì)胞，處理30 min后，收集細(xì)胞用于transwell和western blot的檢測。實驗分為:vector+DMSO組、SOX2+DMSO組、vector+LY294002組和SOX2+LY294002組。Western blo

16、t檢測各組細(xì)胞Akt，p-Akt，mTOR和p-mTOR蛋白的表達(dá)，Transwell實驗檢測各組細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果：LY294002處理細(xì)胞后，無論是對于轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞還是SOX2穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞，p-Akt和p-mTOR蛋白較LY294002處理前表達(dá)下調(diào)，而Akt和mTOR在LY294002處理前后幾乎沒有發(fā)生變化。與SOX2+DMSO組相比，LY294002處理SOX2過表達(dá)細(xì)胞后，細(xì)胞的侵襲能力顯著下降（P＜0.01）。結(jié)論