異種生物衍生材料（羊脫細(xì)胞真皮基質(zhì)）的初步研究.pdf

1、目的：本研究旨在應(yīng)用組織工程學(xué)技術(shù)研制、開發(fā)新的異種生物衍生材料—異種(羊)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(sheep acelluar dermal matrix，SADM)，以SD大鼠為動(dòng)物模型，參照已相對(duì)成熟的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)制備方法，利用異種(羊)皮膚組織，經(jīng)過多步驟的脫細(xì)胞處理，獲得純天然的生物衍生支架材料。通過組織學(xué)研究，分析脫細(xì)胞后的生物衍生材料的組織成分;在透射電鏡下觀察支架材料的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn);通過體內(nèi)、體外的實(shí)驗(yàn)研究，分析異種生物衍生支

2、架材料——羊脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的組織相容性,觀察羊脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架材料的血管化過程，探討其成為皮膚組織工程新的真皮支架材料的可能性；進(jìn)行異種(羊)真皮脫細(xì)胞真皮基質(zhì)作為新型醫(yī)用生物敷料的實(shí)驗(yàn)研究。 方法：（1）應(yīng)用高滲鹽—化學(xué)洗滌劑及酶消化的方法，并與0.2％戊二醛交聯(lián)，對(duì)異種(羊)皮膚組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理，制備純天然的生物衍生支架材料。（2）比較不同濃度TritonX-100對(duì)異種(羊)皮膚組織進(jìn)行脫細(xì)胞作用的影響。（3）應(yīng)用組

3、織學(xué)方法，對(duì)制備的以異種生物衍生支架材料—羊脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的成分進(jìn)行分析。（4）通過透射電鏡觀察異種(羊)脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。（5）應(yīng)用十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳分析羊皮膚I型和III型膠原含量，旨在探討羊皮斷層處理前后羊皮膠原的變化。(（6）) 分別將高滲鹽—化學(xué)洗滌劑及酶消化處理并經(jīng)0.2％戊二醛交聯(lián)及未交聯(lián)的SADM植入SD大鼠體內(nèi)，通過體內(nèi)埋植試驗(yàn)觀察異種(羊)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架材料對(duì)組織的影響，判斷該支架

4、材料的組織相容性，探討異種(羊)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)成為皮膚組織工程支架材料的可能性。 (（7）) 建立SD大鼠創(chuàng)面模型，進(jìn)行異種(羊)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)作為新型醫(yī)用生物敷料的實(shí)驗(yàn)研究。 結(jié)果：（1）異種(羊)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(Sheep Acellular Dermal Matrix , SADM)支架材料的成分分析：①組織形態(tài)學(xué)觀察: 1 ％ TritonX-100脫細(xì)胞后，光鏡下見細(xì)胞輪廓存在，細(xì)胞外觀形態(tài)無明顯變化。但細(xì)胞核有的固

5、縮，有的碎裂，不規(guī)則，細(xì)胞核排列無序，呈現(xiàn)擁擠狀態(tài); 而3 ％ Triton X-100脫細(xì)胞后的支架材料，細(xì)胞成分完全消失，光鏡下見不到細(xì)胞核形態(tài)，粉紅色的膠原纖維排列較疏松，可見細(xì)胞脫除后遺留的空隙。②透射電鏡觀察: 1 ％ Triton X -100脫細(xì)胞后，透射電鏡下見細(xì)胞膜破損，細(xì)胞器破壞、破碎，染色質(zhì)凝集，形成多個(gè)散在的碎塊，有的細(xì)胞核濃縮，并可見到半月狀的凋亡小體。3 ％ TritonX-100脫細(xì)胞后，細(xì)胞器及細(xì)胞核消失

6、，只見殘留的細(xì)胞輪廓，周邊可見不同方向走行的膠原纖維斷面。③斷層處理前后羊皮膚I型和III型膠原含量的測定：結(jié)果表明在斷層處理前后羊皮組織中I型膠原和III型膠原含量均有較明顯變化。（2）異種(羊)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架材料的組織相容性試驗(yàn)：按照生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)的要求，通過SD大鼠體內(nèi)埋植試驗(yàn)完成，經(jīng)觀察，大鼠反應(yīng)正常，試驗(yàn)部位切口愈合良好，未發(fā)現(xiàn)中毒反應(yīng)和死亡。SADM未交聯(lián)組: 植人術(shù)后1周，手術(shù)創(chuàng)口愈合良好,光鏡下可見一些粒細(xì)胞和巨噬細(xì)

7、胞滲入所植入的異種(羊)脫細(xì)胞真皮支架中。在植人的SADM支架材料周圍有成纖維細(xì)胞包繞，但未形成纖維囊包裹，植人物易取出; 鏡下可見有較多中性粒細(xì)胞及少量淋巴細(xì)胞浸潤。植人后2周時(shí)，植人物周圍可見一薄層包裹著半透明的纖維膜，與創(chuàng)面基底緊密相連，鏡下可見巨噬細(xì)胞開始增多，中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞也可見到，宿主創(chuàng)面周圍組織細(xì)胞長入植入的異種(羊)真皮支架內(nèi)，纖維膜與周邊組織分界尚清楚。植人后3周時(shí)鏡下可見有較多中性粒細(xì)胞及少量淋巴細(xì)胞浸潤，一些

8、成纖維細(xì)胞和微血管及非炎性細(xì)胞明顯的出現(xiàn)在SADM支架中。 4周時(shí)，中性粒細(xì)胞開始減少，淋巴細(xì)胞無明顯增多，成纖維細(xì)胞和微血管繼續(xù)長入支架中，8周時(shí)，植入的異種(羊)真皮支架逐漸被SD大鼠結(jié)締組織所替代，纖維膜不再繼續(xù)增厚，膜密度增大，有變薄趨勢(shì)，中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞減少，偶可見到吞噬細(xì)胞，植入物體積明顯變小，有吸收傾向，14周～32周時(shí)植人物消失。SADM交聯(lián)組：界限始終清楚，4周時(shí)植入物周圍可有少量新生血管網(wǎng)，逐漸變薄變軟，此后，更

9、多的成纖維細(xì)胞和微血管長入支架內(nèi)，較非交聯(lián)組緩慢；至36周時(shí)，受植SD大鼠皮下仍可觸及交聯(lián)型SADM。（3）異種(羊)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(SADM)作為創(chuàng)面敷料的觀察：以SADM為覆蓋物的創(chuàng)面愈合效果略差于異體皮覆蓋創(chuàng)面的效果，但明顯優(yōu)于凡士林油紗組覆蓋創(chuàng)面的效果。 結(jié)論：（1）雖然應(yīng)用高滲鹽－化學(xué)洗滌劑及酶消化法制備的異種(羊)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(SADM)具有較完好的基底膜及膠原結(jié)構(gòu)，其質(zhì)地柔軟、彈性及伸展性好、不易斷裂等特點(diǎn)。但

10、本實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，羊皮與豬皮及人皮在組織結(jié)構(gòu)上存在較大的差異性，羊皮的表皮與真皮結(jié)合緊密,羊皮的表皮去除以及真皮內(nèi)汗腺、毛囊細(xì)胞的脫除是較困難的，故在異種(羊)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)制備時(shí)，延長化學(xué)洗滌劑的作用時(shí)間和增加化學(xué)洗滌劑的濃度是十分必要的，并在制備流程中輔用刮除法可提高去除表皮的效果。另外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，即使TritorlX-100濃度達(dá)到4％時(shí)，羊皮真皮層內(nèi)的汗腺、毛囊細(xì)胞只能達(dá)到基本脫盡的效果。（2）異種(羊)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(SADM