Ang-（1-7）和氯沙坦對(duì)5-6腎切除大鼠模型早期MAPK信號(hào)通路的作用.pdf

1、目的：1.研究絲裂素活化蛋白激酶信號(hào)通路(mitogenactivatedproteinkinase，MAPKs)的亞類(lèi)P38蛋白激酶、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignalregulatedproteinkinase，ERK1/2)和c-Jun氨基末端激酶/應(yīng)激激活的蛋白激酶(c-JunN-terminalkinase/stressactivatedproteinkinase，JNK/SAPK)在5/6腎切除大鼠早

2、期發(fā)病機(jī)制中的作用；2.探討血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是否通過(guò)MAPK信號(hào)途徑參與5/6腎切除大鼠早期的發(fā)病機(jī)制；3.觀察血管緊張素1-7[angiotensin1-7，Ang-(1-7)]和氯沙坦(Losartan)在5/6腎切除大鼠早期對(duì)MAPK信號(hào)途徑的調(diào)控及其腎臟保護(hù)作用。 方法：取SPF級(jí)雄性SD(Sprague-Dawlay)大鼠，建立5/6腎切除模型，設(shè)立假手術(shù)組(Sham組)作為對(duì)照，首先

3、進(jìn)行磷酸化P38MAPK的動(dòng)態(tài)研究試驗(yàn)：分別在造模完成后0.5h、1h、3h、6h、12h、1d、2d、4d、1w、2w、4w、6w、8w、10w、12w和16w處死大鼠，明確造模后12h磷酸化P38MAPK信號(hào)最強(qiáng)。然后進(jìn)行干預(yù)試驗(yàn)：以造模后12h為時(shí)間點(diǎn)，設(shè)①假手術(shù)對(duì)照組(Sham組)、②5/6腎切除模型組(STNx組)、③5/6腎切除+Ang-(1-7)干預(yù)組(STNx+A組)、④5/6腎切除+氯沙坦干預(yù)組(STNx+L組)及⑤5

4、/6腎切除+Ang-(1-7)和氯沙坦聯(lián)合干預(yù)組(STNx+A+L組)，各組均于造模完成后12h處死，測(cè)量各組大鼠血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)和8h尿蛋白定量(Upro)；放射免疫法(radioimmunoassay，RIA)測(cè)定血漿和腎組織AngⅡ水平；光鏡和透射電鏡觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的改變；免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry，IHC)檢測(cè)MAPK亞類(lèi)P38MAPK、ERK1/2和JNK/SAP

5、K在腎組織中的表達(dá)和定位；免疫印跡法(westernblotting)檢測(cè)腎皮質(zhì)P38MAPK、ERK1/2和JNK/SAPK的活性。 結(jié)果： 一、5/6腎切除大鼠模型短期動(dòng)態(tài)變化的研究 1.大鼠5/6腎切除術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)Scr和BUN的變化：與Sham組比較，STNx組各時(shí)間點(diǎn)(0.5h、1h、3h、6h、12h、1d、2d和4d)Scr和BUN均明顯升高(P＜0.01)。 2.大鼠5/6腎切除術(shù)后各時(shí)間

6、點(diǎn)腎皮質(zhì)pP38/P38蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)演變：5/6腎切除術(shù)后0.5h、1h、3h、6h和12h的pP38信號(hào)按時(shí)間順序呈遞增趨勢(shì)，以12h信號(hào)最強(qiáng)(P＜0.01)，隨后信號(hào)減弱，2d幾乎不可見(jiàn)，4d有較弱的信號(hào)。1w、2w、4w、6w、8w、10w、12w和16w的pP38表達(dá)極微弱。 二、12h時(shí)各組大鼠干預(yù)實(shí)驗(yàn)的研究 1.各組大鼠Scr、BUN和Upro的改變：與Sham組比較，STNx組Scr、BUN和Upro(8

7、h)均明顯升高(P＜0.01)；Ang-(1-7)和(或)氯沙坦干預(yù)治療后，與STNx組比較，STNx+A、STNx+L及STNx+A+L組的上述指標(biāo)均明顯降低(P＜0.01)；與STNx+A或STNx+L組比較，STNx+A+L組的上述指標(biāo)均有進(jìn)一步降低(P＜0.05)。 2.放射免疫法檢測(cè)各組大鼠血漿和腎組織AngⅡ的含量：與Sham組比較，STNx組血漿和腎組織的AngⅡ含量均顯著升高(P＜0.01)；Ang-(1-7)和

8、(或)氯沙坦干預(yù)治療后，與STNx組比較，STNx+A、STNx+L及STNx+A+L組血漿和腎組織的AngⅡ含量均明顯降低(P＜0.01)；與STNx+A組比較，STNx+A+L組血漿的AngⅡ含量有進(jìn)一步降低(P＜0.05)；與STNx+L組比較，STNx+A+L組血漿和腎組織的AngⅡ含量均有進(jìn)一步降低(P＜0.05)。 3.光鏡組織形態(tài)學(xué)觀察：Sham組腎組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常；STNx組殘腎偶見(jiàn)腎小球系膜細(xì)胞輕度增殖，球

9、囊粘連，問(wèn)質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或輕度腎小管變性；Ang-(1-7)和(或)氯沙坦干預(yù)治療后，STNx+A、STNx+L及STNx+A+L組的上述病變均減輕。 4.電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察：Sham組腎組織超微結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常；STNx組殘腎偶見(jiàn)局灶足突融合，腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞核固縮，核膜間隙擴(kuò)大，染色質(zhì)皺縮，局灶性小管間質(zhì)水腫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，近曲小管細(xì)胞膜內(nèi)褶擴(kuò)張，線粒體排列不齊；Ang-(1-7)和(或)氯沙坦干預(yù)治療后，STNx+A、STN

10、x+L及STNx+A+L組的上述病變均減輕。 5.免疫組化法檢測(cè)各組大鼠腎組織磷酸化P38MAPK(pP38)和總P38MAPK(總P38)、磷酸化ERK1/2(pERK)和總ERK1/2(總ERK)及磷酸化JNK/SAPK(pJNK)蛋白的表達(dá)：各組總P38和總ERK的表達(dá)無(wú)明顯差異，主要表達(dá)于近端小管和遠(yuǎn)端小管，腎小球少量表達(dá)，多在胞漿中表達(dá)，胞核表達(dá)不明顯。而pP38、pERK和pJNK蛋白在Sham組微弱表達(dá)，在STNx

11、組近端小管表達(dá)最豐富(P＜0.01)，活化后的pP38、pERK和pJNK移位入核，可見(jiàn)胞核表達(dá)明顯增多。Ang-(1-7)和(或)氯沙坦干預(yù)治療后，與STNx組比較，STNx+A、STNx+L及STNx+A+L組的pP38、pERK和pJNK表達(dá)均明顯減少(P＜0.01)；與STNx+A或STNx+L組比較，STNx+A+L組的pP38、pERK和pJNK表達(dá)均進(jìn)一步減少(P＜0.05)。 6.免疫印跡法檢測(cè)各組大鼠腎皮質(zhì)pP

12、38和總P38、pERK和總ERK及pJNK和總JNK蛋白的表達(dá)：各組總P38、總ERK和總JNK表達(dá)無(wú)明顯差異。與Sham組比較，STNx組大鼠腎皮質(zhì)pP38，pERK和pJNK水平顯著增高(P＜0.01)；Ang-(1-7)和(或)氯沙坦干預(yù)治療后，與STNx組比較，STNx+A、STNx+L及STNx+A+L組的pP38、pERK和pJNK表達(dá)均明顯降低，接近Sham組(P＜0.01)；與STNx+A或STNx+L組比較，STNx

13、+A+L組的pP38、pERK和pJNK表達(dá)均進(jìn)一步降低(P＜0.05)。 7.相關(guān)分析結(jié)果： ①大鼠腎組織pP38和pERK蛋白的表達(dá)與血漿AngⅡ濃度或腎組織AngⅡ濃度之間均呈顯著正相關(guān)(分別為r=0.613，r=0.578和r=0.904，2=0.887，P均＜0.01，n=50)。 ②大鼠腎組織pJNK蛋白的表達(dá)與血漿AngⅡ濃度或腎組織AngⅡ濃度之間均無(wú)顯著性差異(分別為r=0.097，r=0.05

14、3，P均＞0.05，n=50)。 ③大鼠腎組織pP38蛋白的表達(dá)與pERK蛋白或pJNK蛋白的表達(dá)之間均呈顯著正相關(guān)(分別為r=0.800，r=0.794，P均＜0.01，n=25)。 ④大鼠腎組織pERK蛋白的表達(dá)與pJNK蛋白的表達(dá)之間無(wú)顯著性差異(r=0.296，P＞0.05，n=25)。 結(jié)論： 1.5/6腎切除大鼠模型早期(12h)存在殘腎組織MAPK信號(hào)通路(P38MAPK，ERK1/2，JN

15、K/SAPK)的激活。 2.5/6腎切除大鼠模型早期(12h)激活殘腎MAPK信號(hào)通路，部分機(jī)制為AngⅡ促進(jìn)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化。 3.Ang-(1-7)或氯沙坦均可在5/6腎切除大鼠模型早期(12h)改善腎功能，降低蛋白尿，拮抗AngⅡ的升高及阻斷由AngⅡ刺激的MAPK信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在5/6腎切除大鼠模型早期有腎臟保護(hù)作用。 4.Ang-(1-7)和氯沙坦聯(lián)合干預(yù)可更好改善5/6腎切除大鼠模型早期(