氯化兩面針堿對肝癌抑制作用及機制的研究.pdf

1、氯化兩面針堿(nitidine chloride)屬于苯菲啶型生物堿，為黃治勛等[1]從蕓香科花椒屬( Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.)植物兩面針的干燥根提取的一種生物堿。已有的研究主要是抗炎、鎮(zhèn)痛、解痙等，關(guān)于抗腫瘤療效也有相關(guān)報道，如氯化兩面針堿對慢性細胞型白血病有較好的臨床療效[1]。而對肝癌的治療還在實驗研究階段，目前國內(nèi)外報道很少。我們從體外一方面研究氯化兩面針堿抗肝癌作用及機理；另一方面觀察其對人

2、正常胚肝細胞、人正常胚腎細胞增殖抑制作用影響，結(jié)合小鼠的急性毒性實驗，評價其用藥安全性。 目的： 1通過體外實驗考察氯化兩面針堿體外抗肝癌細胞作用并探討其作用機制。 2通過體外氯化兩面針堿對正常肝腎細胞增殖抑制實驗和小鼠的急性毒性實驗，考察氯化兩面針堿用藥安全性。 方法： 1應(yīng)用MTT法研究體外氯化兩面針堿對人肝癌細胞株SMMC-7721細胞生長的影響。 2應(yīng)用Hoechst熒光染色法及A

3、nnexin V-FITC/PI雙染法等方法研究氯化兩面針堿對人肝癌細胞株SMMC-7721細胞凋亡及細胞周期的影響。 3應(yīng)用免疫組化法研究氯化兩面針堿對SMMC-7721細胞中bcl-2，bax，P53的蛋白表達；透射電鏡觀察腫瘤細胞超微結(jié)構(gòu)。 4通過酶解可見光底物DEVD-pNp測定Caspase-3酶活性。 5采用MTT法檢測對人胚肝細胞L-02、人胚腎細胞293的增殖抑制作用；檢測用藥前后L-02、293

4、細胞超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)的含量變化。 6通過小鼠尾靜脈單次注射氯化兩面針堿，觀察所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)并測定其半數(shù)致死量，評價其急性毒性。 結(jié)果： 1在(0.8-12.8)μg/mL的濃度范圍內(nèi)氯化兩面針堿對人腫瘤細胞株均有不同程度的增殖抑制作用。氯化兩面針堿對人腫瘤細胞株SMMC-7721均表現(xiàn)明顯的細胞毒作用并呈劑量依賴關(guān)系。 2各劑量組(0、2、4、8)μg/m

5、L對細胞周期的影響表現(xiàn)為G2/M期阻滯，作用SMMC-772124h后的凋亡指數(shù)分別為(18.9±0.23)％、(23.3±1.54)％、(28.3±3.83)％，明顯高于對照組(2.0±0.06)％，提示氯化兩面針堿抑制腫瘤細胞增殖可能與細胞周期阻滯和誘導細胞凋亡有關(guān)。 3免疫組織化學方法檢測結(jié)果顯示：加藥組腫瘤細胞中bcl-2、bax和P53均有不同程度的表達，氯化兩面針堿組bcl-2表達較對照組組弱，bax表達較強，而P5

6、3的蛋白表達也有顯著差異(p<0.01)。電鏡下可見氯化兩面針堿給藥組腫瘤細胞核染色質(zhì)濃縮并邊緣化，核碎裂，胞漿空泡化明顯，出現(xiàn)凋亡小體。 4氯化兩面針堿在體外對人正常胚肝細胞L-02，人正常胚腎細胞293的增殖也有一定的抑制作用，且隨藥物劑量的增大，抑制率亦相應(yīng)增大。 5氯化兩面針堿尾靜脈單次給藥的LD50值為其LD50為19.999 mg/kg，LD50的95％平均可信限為(19.999±2.696)mg/kg，LD