兩面針堿衍生物的合成及其免疫抑制活性研究.pdf

1、尋找高效、低毒新型免疫抑制劑用于自身免疫性疾病的治療是當(dāng)前醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)之一。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(topoisomeraseⅠ，TopoⅠ)的活性，特異性地促進(jìn)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌IL-10，顯示出潛在免疫抑制活性，可應(yīng)用于自身免疫性疾病的治療。但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿存在水溶性差，口服生物利用度低等缺陷，限制其進(jìn)一步開發(fā)。本課題在此基礎(chǔ)上以氯化兩面針堿作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，

2、并通過對(duì)衍生物進(jìn)一步活性評(píng)價(jià)，旨在獲得成藥性更優(yōu)的TopoⅠ抑制劑類免疫抑制小分子。
　　首先，在查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，以5-硝基-2，3-萘二酚為起始原料，經(jīng)七步反應(yīng)，以40％的總收率完成了兩面針堿的全合成。以全合成路線為基礎(chǔ)，為獲得水溶性改善的兩面針堿衍生物，進(jìn)行如下結(jié)構(gòu)修飾設(shè)計(jì):(1)在兩面針堿母核C-12位引入羥甲基，經(jīng)14步反應(yīng)，以16％的收率合成了衍生物3-4;(2)依據(jù)已有構(gòu)效關(guān)系，通過兩面針堿母核結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化獲得了三類衍生

3、物，分別為3-22（以苯環(huán)替代萘環(huán)）、3-28（簡(jiǎn)化亞甲二氧基）和3-34（簡(jiǎn)化胡椒環(huán)）;(3)以衍生物3-34為母核結(jié)構(gòu)，在N原子的對(duì)位引入不同含氧基團(tuán)，合成衍生物3-42、3-48、3-52、3-58和3-59。合成實(shí)驗(yàn)部分共完成了8條兩面針堿及其衍生物的合成路線，獲得了40多個(gè)中間體及目標(biāo)化合物，所有中間體及目標(biāo)化合物均通過高分辨質(zhì)譜，1H-NMR和13C-NMR確證結(jié)構(gòu)。
　　其次，對(duì)合成得到的衍生物及中間體進(jìn)行了促進(jìn)IL

4、-10分泌活性、構(gòu)效關(guān)系探討、細(xì)胞毒測(cè)試及TopoⅠ抑制活性研究。
　　一、在2μM濃度下，分別在骨髓來源樹突狀細(xì)胞(Bone marrow-deriveddendritic cells，BMDCs)和巨噬細(xì)胞RAW264.7上進(jìn)行了目標(biāo)化合物的促IL-10分泌活性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，在BMDCs上，所有目標(biāo)化合物及中間體促IL-10分泌活性均弱于對(duì)照化合物兩面針堿;在巨噬細(xì)胞RAW264.7上，部分化合物促IL-10分泌活性顯著優(yōu)于

5、BMDCs上的活性，其中化合物3-15的活性和氯化兩面針堿相當(dāng)，化合物3-14，3-16和3-4促IL-10升高活性相當(dāng)于兩面針堿的80％和73％。根據(jù)在巨噬細(xì)胞RAW264.7上的活性篩選結(jié)果，構(gòu)效關(guān)系總結(jié)如下:
　　(1)兩面針堿母核結(jié)構(gòu)中C-8和C-9位的甲氧基結(jié)構(gòu)是藥效必須基團(tuán);
　　(2)不同種類陰離子對(duì)活性有影響，碘離子替代氯離子使活性減弱;
　　(3)異喹啉環(huán)結(jié)構(gòu)為非必須結(jié)構(gòu)，部分開環(huán)產(chǎn)物也顯示活性;

6、r>　　(4)母核結(jié)構(gòu)中N原子對(duì)位為醛基取代活性優(yōu)于羥基取代。
　　選取部分促IL-10升高活性較好的衍生物，分別在巨噬細(xì)胞RAW264.7和正常肝細(xì)胞L-02上進(jìn)行了細(xì)胞毒性測(cè)試，結(jié)果顯示部分衍生物細(xì)胞毒性弱于對(duì)照化合物氯化兩面針堿。
　　二、在不同濃度下(2-20μM)，評(píng)價(jià)了目標(biāo)化合物的TopoⅠ抑制活性，結(jié)果顯示，在20μM濃度下，衍生物2-13、3-4、3-16、3-22、3-28、3-34、3-48、3-51和3

7、-58具有TopoⅠ抑制活性;特別是在2μM濃度條件下，化合物2-13、3-4、3-16和3-22仍然顯示與兩面針堿和喜樹堿相當(dāng)?shù)腡opoⅠ抑制活性。這一活性測(cè)試結(jié)果表明化合物2-13、3-4、3-16和3-22在TopoⅠ抑制活性和促進(jìn)IL-10分泌活性之間具有一定的一致性，進(jìn)一步的對(duì)接研究也解釋了這些化合物與TopoⅠ的作用方式。
　　基于以上活性研究結(jié)果，選取化合物3-22和3-48在膿毒癥小鼠模型上進(jìn)行體內(nèi)活性研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)

8、果顯示，衍生物3-22和3-48在10 mg/kg時(shí)不能改善膿毒癥小鼠的生存率;但在較低濃度3 mg/kg時(shí)，衍生物3-48能明顯改善膿毒癥小鼠的生存率，84 h時(shí)小鼠的生存率和氯化兩面針堿在3 mg/kg時(shí)的生存率相當(dāng)。結(jié)合細(xì)胞毒性篩選結(jié)果和其他活性數(shù)據(jù)，衍生物3-48可作為優(yōu)選化合物進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
　　綜上所述，本論文通過對(duì)TopoⅠ抑制劑氯化兩面針堿結(jié)構(gòu)改造及其促IL-10分泌活性研究，獲得了新的具有促IL-10升高活性