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文檔簡介
1、背景:垂體腺瘤是顱內(nèi)常見的良性腫瘤,發(fā)病率約占顱內(nèi)腫瘤的10%,且近年呈增多趨勢。目前外科手術治療是垂體腺瘤最常見的治療方式,但仍有部分腫瘤類型如巨大腺瘤及侵襲性垂體腺瘤在臨床上無法全切。當前治療垂體腺瘤的藥物品種少且不良反應較多,垂體腺瘤術后復發(fā)率較高,因此尋找高效、安全且毒副反應小的垂體腺瘤治療藥物當前是研究熱點。氯化兩面針堿是從中藥植物兩面針根中提純的一種生物堿,前期研究表明,氯化兩面針堿對多種腫瘤如肝癌、乳腺癌、腎癌等在體內(nèi)、外
2、均能夠發(fā)揮抑制增殖和誘導凋亡的作用。目前氯化兩面針堿在垂體腺瘤中的作用及機制的研究較少。
目的:探討氯化兩面針堿對垂體腺瘤GH3細胞生長、細胞周期及凋亡的影響并分析其具體機制,研究氯化兩面針堿對垂體腺瘤GH3細胞通路的影響,進而探討氯化兩面針堿作為垂體腺瘤治療藥物的可能性。
方法:⑴細胞分組:依照氯化兩面針堿不同的給藥濃度將GH3細胞分為0μmol/l組、1μmol/l組、2μmol/l組、4μmol/l組和8μmo
3、l/l組,其中0μmol/l組為空白對照組。⑵細胞存活實驗:氯化兩面針堿處理后CCK-8法檢測各組GH3細胞不同時間的存活率。⑶流式細胞術檢測細胞凋亡率:氯化兩面針堿處理細胞24h后,AnnexinⅤ/PI凋亡試劑盒染色后流式細胞術檢測各組GH3細胞凋亡率。⑷流式細胞術進行細胞周期分析:氯化兩面針堿處理細胞12 h后,采用PI染色法用流式細胞術進行細胞周期分析。⑸RT-PCR法檢測目的基因mRNA表達:不同濃度氯化兩面針堿處理的細胞使用
4、TRIzol法提取總RNA,Real-time RT-PCR法檢測不同處理后凋亡相關基因Bax、 Bcl-2和細胞周期相關基因Cyclin B1、CDK1、p21和p27的mRNA表達水平的改變。⑹Western bloting法檢測目的蛋白表達:不同濃度氯化兩面針堿處理的細胞使用Western及IP細胞裂解液裂解,用BCA試劑盒測蛋白濃度。全細胞裂解液使用SDS-PAGE或Tricine-SDS-PAGE膠進行凝膠電泳,免疫印跡檢測B
5、ax、Bc`-2、CyclinB1、CDK1蛋白以及AKT和ERK信號通路蛋白的表達水平。⑺統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0軟件,所得數(shù)據(jù)用(x)±s來表示,組間差異采用t檢驗。p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
結(jié)果:①氯化兩面針堿對GH3細胞增殖的影響氯化兩面針堿對GH3細胞的增殖有明顯的抑制作用,且與劑量、時間呈正相關。②氯化兩面針堿對GH3細胞凋亡的影響氯化兩面針堿明顯增加了GH3細胞的凋亡率,且與劑量正相關;氯化兩面針堿
6、處理后GH3細胞促凋亡分子Bax的mRNA表達水平明顯增加,而抗凋亡分子Bcl-2的mRNA表達水平明顯降低,Bax/Bcl-2的比值明顯增加。③氯化兩面針堿對GH3細胞周期的影響氯化兩面針堿使GH3細胞G2/M期比例增加;氯化兩面針堿處理后,GH3細胞Cyclin B1和CDK1的表達明顯降低,p21和p27表達明顯增加。④氯化兩面針堿對GH3細胞通路激活的影響氯化兩面針堿可降低GH3細胞AKT和ERK的磷酸化水平,抑制AKT和ERK
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