HMGB1與LPS協(xié)同激活類風濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶的分子機制.pdf

1、類風濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病，以非化膿性增生性滑膜炎為特點，逐漸導致關(guān)節(jié)軟骨的破壞及關(guān)節(jié)功能的障礙。目前，尚無被證實有導致本病的直接感染因子，但一些細菌、病毒及其代謝產(chǎn)物如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可能通過某些途徑影響RA的發(fā)病和病情進展。近年來研究顯示類風濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞(Rheumatoid arthritis synovial fibrob

2、lasts，RASF)在RA的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著T淋巴細胞依賴途徑所不可解釋的重要作用，如分泌大量促炎細胞因子、趨化因子和金屬蛋白酶，引發(fā)滑膜炎癥反應(yīng)、導致軟骨基質(zhì)的崩解。高遷移率族蛋白1(high mobility group box protein1，HMGB1)是一種普遍存在于真核細胞中的染色體蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可于細胞外分泌釋放，參與細胞的分化、遷移和再生，并可介導多種炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生。在RA患者及實驗性關(guān)節(jié)炎

3、動物關(guān)節(jié)局部HMGB1的表達明顯上調(diào)，這些異常表達的HMGB1可通過多種分子機制在關(guān)節(jié)炎發(fā)病的多個環(huán)節(jié)中發(fā)揮作用，介導慢性炎癥的持續(xù)和局部組織的侵蝕破壞。雖然RASF在關(guān)節(jié)炎中的作用已得到肯定，但目前尚不清楚HMGB1是否能激活RASF產(chǎn)生破壞侵蝕關(guān)節(jié)軟骨的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)及其分子機制。本研究旨在：目的研究HMGB1協(xié)同LPS在激活RASF表達MMPs情況，探討HMGB1協(xié)同

4、LPS在激活RASF引起關(guān)節(jié)損傷的可能途徑；初步闡明HMGB1協(xié)同LPS激活RASF表達MMPs的分子機制。方法RA患者行滑膜切除術(shù)或人工關(guān)節(jié)置換術(shù)時無菌取關(guān)節(jié)滑膜，分離培養(yǎng)RASF，將培養(yǎng)3—8代RASF用來實驗。采用流式細胞儀分析的方法檢測RASF給予HMGB1和或LPS刺激后細胞的增殖情況；采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real—time RT—PCR)的方法檢測RASF中MMP—1、MMP—3、MMP—13、IL—6等mRNA的表達

5、水平。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme—linkedimmunosorbent assay，ELISA)檢測培養(yǎng)上清液中MMP—3、MMP—13和IL—6濃度：采用western blotting分析細胞內(nèi)NF—κB和磷酸化I—κB、P13K和磷酸化P13K、p38MAPK和磷酸化p38 MAPK等細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導分子表達水平的變化；利用受體阻斷性抗體(Anti—TLR2和Anti—TLR4)和競爭性融合蛋白(RAGE—Fc)與HMGB

6、1和或LPS刺激RASF共培養(yǎng)，采用Real—time RT—PCR及ELISA分別檢測MMP—1、MMP—3、MMP—13和IL—6等mRNA表達水平及MMP—3、MMP—13和IL—6濃度。結(jié)果HMGB1和或LPS激活RASF使其進入S期的細胞明顯增多，分別為CON：6．55％；HMGB1：8．66％；LPS：8．89％；IL—1β：9．02％；HMGB1+LPS：9．60％；HMGB1+IL—1β：9．96％。激活后RASF與對照

7、組相比MMP—3、MMP—13、IL—6等mRNA水平的表達增高，MMP—1mRNA表達水平無明顯差異；培養(yǎng)上清液中MMP—3、MMP—13和IL—6濃度增高。利用受體阻斷性抗體(Anti—TLR2和Anti—TLR4)和競爭性融合蛋白(RAGE—Fc)阻斷HMGB1目前已知的3個受體來研究HMGB1作用的可能途徑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阻斷TLR2受體不影響LPS和或HMGB1激活RASF；而阻斷LPS受體TLR4后，RASF不被激活，上清中檢測I

8、L—6和MMP—3、MMP—13水平與對照組基本一致；Real—timeRT—PCR檢測也顯示MMPs等mRNA表達水平?jīng)]有明顯變化。采用競爭性融合蛋白(RAGE—Fc)阻斷高度糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)后，HMGB1和LPS協(xié)同刺激RASF的效應(yīng)減弱了，表現(xiàn)為上清液中IL—6和MMP—3、MMP—13濃度較未阻斷組明顯下降，Real—time

9、RT—PCR檢測也顯示mRNA水平較未阻斷組明顯下調(diào)；采用SB203580特異性抑制MAPK p38磷酸化后，HMGB1與LPS之間的協(xié)同激活RASF作用減弱，采用Bayll—7085特異性抑制NF—κB的活化后，則RASF不被HMGB1與LPS激活；采用Western blotting實驗進一步證實了上述推測，HMGB1和LPS聯(lián)合作用于RASF15min MAPK p38磷酸化水平和NF—κB活化水平顯著高于HMGB1或LPS單獨作

10、用組，并且用RAGE—Fc融合蛋白預(yù)處理可以下調(diào)HMGB1和LPS聯(lián)合作用組MAPK p38和NF—κB蛋白磷酸化水平。結(jié)論HMGB1協(xié)同LPS激活RASF產(chǎn)生致炎細胞因子和MMPs等導致軟骨組織損傷性的酶，并導致細胞生長周期的改變；由于LPS可通過Toll樣受體4(Toll—like receptor，TLR4)激活RASF，而RASF表達的TLR4可能同時接受HMGB1和LPS作用。因此，HMGB1可能通過與RASF表面的結(jié)合，協(xié)同

11、參與LPS的刺激作用；HMGB1是通過結(jié)合RAGE增強下游MAPK p38的磷酸化和NF—κB的活化而發(fā)揮作用。通過研究HMGB1的胞外作用，探討其在RASF中產(chǎn)生致炎細胞因子和導致關(guān)節(jié)破壞的酶的作用和信號轉(zhuǎn)導途徑，我們推測，RA時局部異常表達的HMGB1一方面通過激活RASF招募炎性細胞，發(fā)揮促炎細胞因子的作用參與局部炎癥的啟動、放大和維持；另一方面，通過激活RASF參與自身免疫反應(yīng)，進而參與維持了RA慢性炎癥過程，并導致關(guān)節(jié)組織的侵