鞘磷脂合酶Ⅰ在氧化應(yīng)激損傷中的表達(dá)及其作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　探討鞘磷脂合酶1(sphingomyelin synthase1，SMS1)在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞凋亡中的作用，與神經(jīng)酰胺和ERK通路的關(guān)系，探討SMS1可能的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.體外培養(yǎng)小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞(N2a)細(xì)胞，用不同濃度梯度的過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)建立氧化應(yīng)激模型，并用MTT法和光鏡顯微鏡評(píng)價(jià)模型。用Real-time PCR和w

2、estern blot檢測(cè)不同濃度梯度H2O2處理的細(xì)胞中SMS1的基因和蛋白水平變化。
　　2.實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、H2O2組、H2O2+D609組和D609組。對(duì)照組:用含1％小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液孵育N2a細(xì)胞24h; H2O2組:用含150μM H2O2的培養(yǎng)液孵育N2a細(xì)胞24h; H2O2+D609組:用SMS1的抑制劑50μtM D609孵育N2a細(xì)胞3h后，加入終濃度為150μM的H2O2培養(yǎng)液孵育N2a細(xì)胞24

3、h; D609組:先用抑制劑50μM D609孵育N2a細(xì)胞3h，然后改用含1％小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育N2a細(xì)胞24h。采用Real-Time PCR法從基因水平檢測(cè)SMS1表達(dá)， Western-blot法從蛋白水平檢測(cè)SMS1及磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(phospho-extracellular signal-regulated kinase，p-ERK)表達(dá)。質(zhì)譜-液相色譜聯(lián)用分析法檢測(cè)神經(jīng)酰胺水平。 Hoechst

4、33342染色法和流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果:
　　1.H2O2刺激后細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化，MTT顯示:MTT的吸光度值隨著H2O2濃度的梯度樣升高而逐漸降低，表明H2O2降低了細(xì)胞活性。
　　2.H2O2組（50μM，100μM，150μM）呈濃度依賴性地上調(diào)SMS1的蛋白和基因水平的表達(dá)。
　　3.與正常N2a細(xì)胞對(duì)照組相比，H2O2（150μM）處理組顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)SMS1的蛋白和基因表達(dá)水平(

5、P＜0.01)，并明顯增加p-ERK的蛋白表達(dá)水平(P＜0.01)。SMS1抑制劑D609預(yù)處理組可抑制H2O2處理后的SMS1表達(dá)上調(diào)，并降低p-ERK的蛋白表達(dá)水平（P＜0.01），單用D609組與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　4.與對(duì)照組相比，H2O2（150μM）處理組可升高細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺水平(P＜0.05)，SMS1抑制劑D609預(yù)處理可使H2O2刺激導(dǎo)致的神經(jīng)酰胺增多更加顯著(P＜0.05)。
　　5.