鉛誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng).pdf

1、目的： 重金屬鉛是一種普遍存在的環(huán)境神經(jīng)毒物，低水平的慢性鉛暴露對(duì)嬰幼兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)不可逆的損害以及對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響是一個(gè)備受關(guān)注的重大問題。嬰幼兒的消化道對(duì)鉛的吸收率較成人約高5倍，而排泄率較成人低，加之兒童血腦屏障發(fā)育不全，因此鉛極易在嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生蓄積。0～6歲兒童的大腦智力發(fā)育對(duì)鉛的敏感性高于成人30倍，我國很多城市兒童鉛中毒已達(dá)到36-40％，是美國兒童的10余倍。研究表明當(dāng)兒童的血鉛由0.48μM升高到0.9

2、7μM時(shí)，智商平均下降2～6分。 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞占人類腦細(xì)胞的90％，是神經(jīng)系統(tǒng)的支持細(xì)胞，在構(gòu)成髓鞘、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育、神經(jīng)組織修復(fù)和再生等方面有重要作用，其中的一大類細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育、遷移、突觸的形成、遞質(zhì)傳遞的調(diào)節(jié)、能量供應(yīng)以及維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，都起著十分重要的作用。目前研究認(rèn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte)較內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)鉛更為敏感，認(rèn)為鉛可能是通過損害星形膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而損害內(nèi)皮細(xì)胞，從而增加血-腦

3、屏障通透性而進(jìn)入腦，最終損害腦功能的。 研究發(fā)現(xiàn)，缺氧、低糖、重金屬等應(yīng)激信號(hào)可以使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum，ER)內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白增多，可誘發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded proteinreaction，UPR)，通過上調(diào)分子伴侶如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated proteins，GRP78)等幫助蛋白正確折疊以減輕細(xì)胞損傷。當(dāng)應(yīng)激強(qiáng)度過大，ER功能嚴(yán)重受損時(shí)細(xì)胞將啟動(dòng)生長抑制

4、DNA損傷誘導(dǎo)因子(growth arrest and DNA damageinducible gene，GADD153)等信號(hào)觸發(fā)細(xì)胞凋亡。 有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，暴露于較高濃度鉛環(huán)境的幼鼠腦中的鉛大部分被隔離在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，并可以檢測(cè)出一種分子量為23KD的新蛋白可以結(jié)合鉛，另外，也有學(xué)者提出，星形膠質(zhì)細(xì)胞可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蓄積大量的鉛，從而保護(hù)更為敏感的神經(jīng)元。這些證據(jù)表明，在非生理性金屬的刺激下，機(jī)體很可能啟動(dòng)了一種耐受機(jī)制，即

5、染鉛后星形膠質(zhì)細(xì)胞通過某些蛋白的高表達(dá)與鉛螯合，作為鉛蓄積庫以保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。 本研究用醋酸鉛作用于原代培養(yǎng)的腦星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和CyclinD1、GADD153及GRP78表達(dá)量的影響。為了探討GRP78是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上鉛作用的靶蛋白，本研究還觀察了細(xì)胞內(nèi)鉛離子與GRP78的螯合作用，以及鉛誘導(dǎo)GRP78表達(dá)的一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以證明GRP78是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種鉛結(jié)合蛋白。 方法：

6、 1、Wistar大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)，分別加入醋酸鉛、PD98059(ERK上游激酶MEK1的特異性抑制劑)及Wortmannin(PKB上游激酶PI3K的特異性抑制劑)培養(yǎng)不同時(shí)間，加入醋酸鈉作為對(duì)照。 2、免疫組化法觀察細(xì)胞GFAP表達(dá)以鑒定原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度。 3、MTT比色法觀察醋酸鉛對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響。 4、流式細(xì)胞技術(shù)分析醋酸鉛對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程的影響。

7、 5、Western blot法檢測(cè)醋酸鉛誘導(dǎo)CyclinD1和GADD153蛋白表達(dá)變化。 6、免疫沉淀方法純化出醋酸鉛誘導(dǎo)的GRP78蛋白，Western blot方法檢測(cè)純化的GRP78蛋白量變化，石墨爐原子吸收法檢測(cè)純化產(chǎn)物中的鉛含量。 7、膠體金免疫電鏡法觀察醋酸鉛誘導(dǎo)的GRP78定位的改變。 8、Western blot和RT-PCR方法檢測(cè)鉛誘導(dǎo)的ERK和PKB活性的變化，以及其誘導(dǎo)GRP78表達(dá)的

8、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 結(jié)果： 1、免疫組化法結(jié)果顯示：原代培養(yǎng)腦星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過差速粘附處理后，傳代2～4代后，細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定。經(jīng)顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察，95％以上的細(xì)胞胞漿著黃褐色，胞核著藍(lán)色，證明絕大多數(shù)培養(yǎng)的原代細(xì)胞為星形膠質(zhì)細(xì)胞。 2、MTT比色法結(jié)果顯示：醋酸鉛可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，且與鉛的水平呈劑量依賴關(guān)系，1.0μM醋酸鉛濃度作用細(xì)胞8天起，細(xì)胞增殖比下降具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3、流式細(xì)

9、胞技術(shù)結(jié)果顯示：與醋酸鈉對(duì)照相比，經(jīng)1.0μM醋酸鉛處理8、12、15、30 d后，星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯在G1期(58.64±1.75％→69.81±1.56％，70.80±1.27％，90.59±1.25％，80.9±1.11％)。 4、Western blot結(jié)果顯示： (1)醋酸鉛使星形膠質(zhì)細(xì)胞CyclinD1蛋白表達(dá)呈時(shí)效依賴性下降趨勢(shì)(P<0.05)。 (2)1.0μM醋酸鉛作用于細(xì)胞30天以后，

10、星形膠質(zhì)細(xì)胞GADD153蛋白開始表達(dá)。 (3)醋酸鉛能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)GRP78蛋白表達(dá)增加，此誘導(dǎo)作用具有量效依賴性和時(shí)效依賴性。0.2、1.0、10μM的醋酸鉛作用于細(xì)胞24小時(shí)，都可誘導(dǎo)GRP78表達(dá)的增加，1.0和10μM醋酸鉛效果顯著(P<0.01)。1.0 μM的醋酸鉛作用于細(xì)胞24小時(shí)后，GRP78表達(dá)量顯著增高，4～8天左右達(dá)到峰值(P<0.01)，約12天左右表達(dá)量開始下降，至染鉛30天時(shí)仍高于對(duì)照組(

11、P<0.05)。P13K抑制劑wortmannin和MEK1抑制劑PD98059均能抑制醋酸鉛誘導(dǎo)的GRP78蛋白表達(dá)的增加(P<0.05)，wortmannin的抑制效果更明顯。 (4)醋酸鉛能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK蛋白活性增高，具有時(shí)效依賴性和量效依賴性。0.2、1.0、10μM的醋酸鉛作用于細(xì)胞30分鐘，都可誘導(dǎo)ERK活性增高，以1.0μM的醋酸鉛效果最明顯(P<0.05)。1.0μM的醋酸鉛作用于細(xì)胞5分鐘時(shí)ERK活性開

12、始增高，30分鐘時(shí)達(dá)到峰值，隨后又逐漸降至正常水平。MEK1抑制劑PD98059能抑制醋酸鉛誘導(dǎo)的ERK活性增高(P<0.05)。 (5)醋酸鉛能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞PKB蛋白活性增高，具有時(shí)效依賴性和量效依賴性。0.2、1.0、10μM的醋酸鉛作用于細(xì)胞30分鐘，都可誘導(dǎo)PKB活性增高，以1.0μM的醋酸鉛效果最明顯(P<0.05)。1.0μM的醋酸鉛作用于細(xì)胞5分鐘時(shí)PKB活性開始增高，30分鐘時(shí)達(dá)到峰值，隨后又逐漸降至正常水平

13、。PI3K抑制劑wortmannin能抑制醋酸鉛誘導(dǎo)的PKB活性增高(P<0.05)。 5、免疫沉淀及石墨爐原子吸收法結(jié)果顯示：GRP78能緊密螯合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的鉛離子。1.0μM醋酸鉛處理細(xì)胞后，用親和層析法將細(xì)胞裂解液中的GRP78蛋白純化，western blot方法檢測(cè)純化產(chǎn)物為分子量78KD的單一蛋白質(zhì)。純化后的產(chǎn)物用石墨爐原子吸收儀檢測(cè)鉛含量，1.0μM醋酸鉛作用于細(xì)胞24小時(shí)后純化產(chǎn)物中的鉛含量開始顯著增高，8天左右

14、達(dá)到峰值(P<0.01)，隨后鉛含量下降，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)。 6、膠體金免疫電鏡結(jié)果顯示：1.0μM醋酸鉛作用于細(xì)胞24小時(shí)后，星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)GRP78的表達(dá)量開始顯著增加，并且其定位由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移至胞核周圍胞漿。10μM醋酸鉛作用于細(xì)胞10小時(shí)后，細(xì)胞也有類似變化。 7、RT-PCR分析結(jié)果顯示： (1) 醋酸鉛能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的GRP78 mRNA表達(dá)增加，具有時(shí)效依賴性和量效依賴性；PI

15、3K抑制劑wortmannin和MEK1抑制劑PD98059都可抑制醋酸鉛的作用(P<0.05)，wortmannin的抑制效果更為明顯。 (2)醋酸鉛能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的ERK2 mRNA表達(dá)增加(P<0.05)。MEK1抑制劑PD98059可抑制此作用。 結(jié)論： 1、在原代培養(yǎng)的鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞中，醋酸鉛可誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)，使細(xì)胞CyelinD1蛋白水平下降，細(xì)胞周期停滯在G1期；長時(shí)間鉛暴露甚至可誘導(dǎo)GA

16、DD153蛋白表達(dá)，但并未觀察到細(xì)胞的凋亡。 2、醋酸鉛誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)GRP78 mRNA水平和蛋白水平表達(dá)增加，PI3K抑制劑wortmannin和MEK1抑制劑PD98059都可阻斷此誘導(dǎo)作用。醋酸鉛可依賴MEK1/ERK、PI3K/PKB通路促進(jìn)GRP78表達(dá)。 3、細(xì)胞內(nèi)的GRP78可以與鉛離子緊密螯合，此作用具有量效依賴性。 4、醋酸鉛經(jīng)MEK途徑迅速激活星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK活性，經(jīng)P13K途徑迅