肺結(jié)核患者外周血中樹突狀細(xì)胞亞群的變化及結(jié)核桿菌耐熱性抗原對(duì)樹突狀細(xì)胞的影響.pdf

1、研究背景：已有研究證明，人體內(nèi)樹突狀細(xì)胞(DCs)亞群，在許多疾病包括結(jié)核病(TB)中都有不同程度的改變，但在不同分期肺結(jié)核(PTB)患者體內(nèi)DCs亞群的變化有何不同尚不清楚。已有報(bào)導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌對(duì)DCs的功能有抑制作用，從結(jié)核桿菌H37Ra株中提取的結(jié)核桿菌耐熱性抗原(Mtb-HAg)是一種能優(yōu)勢(shì)誘導(dǎo)γδ-T細(xì)胞活化的小分子多肽，但對(duì)DCs的成熟和功能有何影響也尚未報(bào)道。
　　目的：研究不同分期肺結(jié)核患者外周血來源的DCs亞群即

2、髓樣樹突狀細(xì)胞(myeloid dendritic cells, MDC)和淋巴樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cell, PDC)的變化，及Mtb-HAg在體外對(duì)人外周血單核細(xì)胞來源的DCs誘導(dǎo)成熟的影響。
　　方法：
　　1．DCs亞群測(cè)定方法：采集32例健康者(HD)和56例PTB患者外周靜脈抗凝全血，用四色熒光抗體染色后在流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析 DCs亞群， MDC(Lin-HLA-DR+C

3、D11c+)，和 PDC(Line-HLA-DR+CD123+)，根據(jù)診治情況又將PTB患者分為初治組和復(fù)治組。
　　2．DCs培養(yǎng)方法：從健康人外周血，分離獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)后，用貼壁法獲得單核細(xì)胞，加GM-CS和IL-4培養(yǎng)7天，再用LPS或Mtb-HAg誘導(dǎo)再培養(yǎng)2 d。
　　3．培養(yǎng)DCs的形態(tài)學(xué)觀察：取培養(yǎng)第2 d的細(xì)胞及第9 d

4、經(jīng)Mtb-HAg誘導(dǎo)的DCs，用抗CD14-FITC、抗CD11c-APC染色后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)。4．培養(yǎng)DCs的表型測(cè)定：培養(yǎng)的DCs用熒光抗體標(biāo)記后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面共刺激分子CD80，CD86和HLA-DR及DCs成熟的標(biāo)志CD83，以及MDC表面標(biāo)志CD11c、PDC的表面標(biāo)志CD123的表達(dá)。
　　5．混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)：CFSE標(biāo)記的純化T淋巴細(xì)胞與Mtb-HAg或LPS誘導(dǎo)的DCs共同培養(yǎng)，

5、第9 d用流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析T淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1. PTB患者(n=56)的PDC(0.91±0.10)％顯著低于 HD組(n=32)(1.62±0.14)%(P<0.05)，MDC在PTB組、HD組之間無差異(P=0.17)，PTB患者的MDC/PDC比值也明顯高于HD組(P<0.05)。
　　2. PTB復(fù)治組(n=25)的PDC(0.63±0.09)%明顯低于初治組(n=31)(1.14±0

6、.16)%和HD組(n=32)(1.63±0.15)%(p均<0.05)，但初治組與HD組之間無差異。而MDC在三組之間并無差異(P=0.08)。但是MDC/PDC比值在PTB復(fù)治組（5.30±1.35）明顯高于初治組（3.52±0.53）和HD組（1.84±0.16）(p均<0.05）。
　　3.體外培養(yǎng)的單核細(xì)胞來源的DCs，經(jīng) Mtb-HAg誘導(dǎo)后，形態(tài)上為典型成熟的DCs，表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大，不規(guī)則，細(xì)胞周邊可見較長(zhǎng)的毛刺

7、狀突起。用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)初期的單核細(xì)胞表達(dá)CD14，培養(yǎng)成熟后多為表達(dá)MDC標(biāo)志CD11c。
　　4.外周血單核細(xì)胞經(jīng)rhGM-CSF和rhIL-4培養(yǎng)7 d，再經(jīng)Mtb-HAg誘導(dǎo)2 d后，單核細(xì)胞標(biāo)志 CD14小于10%，高表達(dá)成熟標(biāo)記 CD83(64.45%),共刺激分子CD86(76.3%) CD80(78.87%)及 HLA-DR(76.48)%，大多數(shù)細(xì)胞表達(dá) MDC標(biāo)志CD11c(74.98)%，少數(shù)表達(dá)P

8、DC標(biāo)志CD123(10.31)%。
　　5.用Modift軟件分析CFSE標(biāo)記純化T細(xì)胞與三組DCs混合培養(yǎng)9 d后的細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）發(fā)現(xiàn)，Mtb-HAg誘導(dǎo)組的PI(41.47±5.64)%明顯大于陰性對(duì)照組(9.16±5.24)%，(P＜0.05)，與LPS誘導(dǎo)陽(yáng)性對(duì)照組(34.71±6.21)%無差異。
　　結(jié)論：
　　1.與HD組相比，PTB患者DC亞群中PDC的數(shù)量明顯減少，而MDC變化不明顯，同時(shí)MD

9、C/PDC的比值也明顯升高。
　　2. PTB復(fù)治組患者PDC均明顯低于初治組和HD組，MDC/PDC比值明顯高于初治組和HD組，而初治組與HD組之間無明顯差異；MDC在三組之間無差異；提示PDC數(shù)量與病情進(jìn)展密切相關(guān)。
　　3. Mtb-HAg可上調(diào)外周血單核細(xì)胞來源DCs的協(xié)同刺激分子和成熟標(biāo)志表達(dá)，以及增強(qiáng)MLR反應(yīng)，提示Mtb-HAg有誘導(dǎo)DCs成熟和增強(qiáng)抗原提呈功能的作用。
　　4. Mtb-HAg誘導(dǎo)外周血