HSV1-tk-FIAU報告基因顯像系統(tǒng)在心肌細胞的體外攝取動力學研究.pdf

1、目的： 構建攜帶單純皰疹病毒1型胸苷激酶基因(HSV1-tk)的重組質(zhì)粒和重組腺病毒載體，對比研究重組腺病毒和脂質(zhì)體包裹的重組質(zhì)粒體外轉導乳鼠心肌細胞后，對核素標記的報告探針131I-FIAU的攝取和基因表達情況，為核素報告基因心臟顯像尋找合適的載體并提供基礎。 方法： 1．重組質(zhì)粒與重組腺病毒的構建及鑒定 以含巨細胞病毒(CMV)啟動子的pDC316為載體質(zhì)粒，將報告基因HSV1-tk插入多克隆位點，構

2、建重組質(zhì)粒pDC316-tk；以pDC316-tk作為重組穿梭質(zhì)粒，與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉染293細胞，包裝生成腺病毒重組體Ad5-tk，本部分與北京本元正陽公司合作完成。含增強型綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒Ad5-EGFP作為對照病毒。 2．SD大鼠乳鼠心肌細胞培養(yǎng) 無菌操作取1～3 d齡SD大鼠乳鼠心室組織，剪成1mm3的組織碎塊，采用0.1％II型膠原酶單次消化法消化組織塊，1 h差速貼壁法純化心肌細胞，于37℃、5

3、％CO2環(huán)境下培養(yǎng)。生物倒置顯微鏡下動態(tài)觀察心肌細胞形態(tài)。 3．脂質(zhì)體包裹重組質(zhì)粒轉染體外培養(yǎng)的心肌細胞 心肌細胞貼壁生長達90％融合時，重組質(zhì)粒pDC316-tk經(jīng)脂質(zhì)體lipofectamineTM 2000包裹(pDC316-tk/lipoplex)后加入培養(yǎng)孔內(nèi)，37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育4h后將轉染液替換為含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24h。 4．重組腺病毒感染體外培養(yǎng)的心肌細胞 心肌細胞貼

4、壁生長達90％融合時，計數(shù)培養(yǎng)孔內(nèi)心肌細胞數(shù)目，以感染復數(shù)(MOI)20、40、80計算所需病毒體積，opti-MEM稀釋后加入培養(yǎng)孔中，37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育4h后換成含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24h。 5．FAU的碘化標記 采用Iodogen固相氧化法對FAU進行放射性碘標記，標記產(chǎn)物用Sep-Pak C-18反相色譜層析柱進行純化和標記率分析，TLC-SG硅膠板薄層層析法測定131I-FIAU的放射化學純

5、度和體外穩(wěn)定性。 6．Ad5-tk和pDC316-tk/lipoplex轉導心肌細胞后體外攝取及基因表達的比較 心肌細胞轉導Ad5-tk和pDC316-tk/lipoplex后37℃孵育24h，進行131I-FIAU的攝取實驗，比較兩種載體介導細胞轉導后對報告探針的攝取效率；應用半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和免疫細胞化學方法，分別在mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測不同載體轉導后心肌細胞內(nèi)HSV1-tk的表達情況；用

6、四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法評價轉導后心肌細胞活力。 結果： 1. 與本元正陽公司協(xié)作構建的重組質(zhì)粒pDC316-tk經(jīng)PCR、酶切鑒定和測序鑒定證明序列正確，包裝生成的重組腺病毒Ad5-tk的物理滴度(v.p./ml)為1.1×1012，感染滴度(TCID50/ml)達1.6×1010。 2. 0.1％II型膠原酶單次消化法獲得的心肌細胞活力強，培養(yǎng)24h后，倒置顯微鏡下見心肌細胞相互交聯(lián)，部分心肌細胞成團跳

7、動，48h可見多個細胞集落同步跳動。 3. Iodogen固相氧化法能有效碘化標記FAU，標記反應產(chǎn)物經(jīng)Sep-Pak C-18反相色譜柱純化后，峰管的標記率為(53.82±2.05)％。經(jīng)TLC-SG硅膠板層析測定放射化學純度為(94.85±1.76)％(n=5)。標記物在室溫下放置4、12、24h后，放射化學純度仍大于90％。 4. Ad5-tk和pDC316-tk/lipoplex轉導的心肌細胞對131I-FIAU

8、的攝取均隨時間延長逐漸增加，在5h達最高攝取率，分別為(12.55±0.37)％，(2.09±0.34)％，但前者各時間點攝取率均高于后者(P<0.01)。兩種載體介導心肌細胞轉導后24h，RT-PCR即可檢測到HSV1-tk mRNA的表達，且Ad5-tk感染組的表達水平明顯高于pDC316-tk/lipoplex轉染組(3.11±0.14 vs 1.60±0.05，P<0.01)；免疫細胞化學檢測顯示Ad5-tk感染組和pDC316

9、-tk/lipoplex轉染組的陽性率分別為(81.70±0.40)％、(22.06±0.32)％，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；MTT實驗結果顯示，心肌細胞感染高滴度Ad5-tk后細胞活力下降較pDC316-tk/lipoplex轉染組明顯。 結論： 用重組腺病毒和脂質(zhì)體包裹重組質(zhì)粒做載體，均能成功介導報告基因HSV1-tk進入心肌細胞，并表達生成有生物活性的酶對核素標記報告探針131I-FIAU有明確的攝取，但通