HSV1-tk-FIAU報告基因系統(tǒng)心臟SPECT顯像的實驗研究.pdf

1、目的:構(gòu)建攜帶單純皰疹病毒1型胸苷激酶基因（herpes simplex virus 1-thymidine kinase,HSV1-tk）的重組腺病毒載體（Ad5-tk）并將其轉(zhuǎn)染動物心肌，通過在體放射性自顯影（autoradiography，ARG）及單光子發(fā)射計算機(jī)斷層（single photon emission computedtomography，SPECT）顯像研究探討用氟-碘阿糖基脲嘧啶（131 I-2-fluoro-2

2、-deoxy-1-β-D-arabinofuranosyl-5-iodouracil，131 I-FIAU）作為報告探針，用HSV1-tk作為報告基因心臟顯像的可行性，并探討顯像所需病毒滴度及顯像的時間過程，為此報告系統(tǒng)應(yīng)用于人類的心臟報告基因顯像提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定以含巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動子的pDC316 為載體質(zhì)粒，將報告基因HSV1-tk插入多克隆位點，構(gòu)建重組質(zhì)粒pD

3、C316-tk,以pDC316-tk作為重組穿梭質(zhì)粒，與腺病毒（Adenovirus，Ad）骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝生成腺病毒重組體Ad5-tk,本部分與北京本元正陽公司合作完成。
　　 2.131 I-FIAU的標(biāo)記及質(zhì)量鑒定利用Iodogen 固相氧化法對FAU 進(jìn)行碘化標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物用Sep-Pak C-18 反相層析色譜小柱進(jìn)行純化及標(biāo)記率分析，TLC-SG 硅膠板薄層層析法測定標(biāo)記產(chǎn)物的放射化學(xué)純度，并觀察131

4、 I-FIAU 在37 ℃新鮮正常人血清中放置4h、12h和24h后的體外穩(wěn)定性。
　　 3.大鼠心肌報告基因表達(dá)的放射性自顯影SD大鼠心肌內(nèi)注射Ad5-tk。根據(jù)目的不同進(jìn)行分組如下：①轉(zhuǎn)染報告基因后時間對顯像的影響：心肌內(nèi)轉(zhuǎn)染110 8 pfu Ad5-tk后第1、2、3、5、7d 注射131 I-FIAU。②不同轉(zhuǎn)染滴度對顯像結(jié)果的影響：心肌內(nèi)注射不同滴度的Ad5-tk (510 8 pfu,110 8pfu,510 7

5、pfu,110 7 pfu)，2d后注射131 I-FIAU。對照組均采用注射同體積的空載腺病毒（Ad5-null）。所有動物在注射131 I-FIAU 24 h后斷頸法處死，取出心臟，測量γ計數(shù)值，行ARG 研究，RT-PCR和免疫組織化學(xué)分別從mRNA 水平和蛋白水平證實HSV1-tk基因表達(dá)，并對ARG圖像和RT-PCR圖像行半定量分析，探討體內(nèi)ARG圖像上ROI的T/NT與體外γ計數(shù)及基因表達(dá)的mRNA 水平間的相關(guān)性，尋求獲得

6、最佳圖像的轉(zhuǎn)染滴度及基因表達(dá)時間。
　　 4.家兔心肌報告基因表達(dá)的SPECT 顯像家兔心肌內(nèi)注射Ad5-tk，根據(jù)目的不同進(jìn)行分組如下：①轉(zhuǎn)染報告基因后不同時間對顯像結(jié)果的影響：家兔心肌內(nèi)注射不同滴度的Ad5-tk（110 9 pfu,510 8 pfu,110 8pfu,510 7 pfu,110 7 pfu），2d后耳緣靜脈注射131 I-FIAU 600Ci，于注射后6h、24h、48h和72h 行心肌SPECT 顯像，

7、注射110 9 pfu Ad5-tk的家兔繼續(xù)行96h和120h 顯像；②不同Ad5-tk 滴度對顯像結(jié)果的影響：家兔心肌注射不同滴度的Ad5-tk（110 9pfu,510 8 pfu,110 8 pfu,510 7 pfu,110 7 pfu），2d后耳緣靜脈注射131 I-FIAU 600Ci 行6h、24h和48h 心肌SPECT 顯像。對照組均采用注射同體積的無菌生理鹽水。第二組動物顯像結(jié)束后處死，取出心臟，測量γ計數(shù)值，行R

8、T-PCR 及免疫組織化學(xué)研究，對SPECT和RT-PCR圖像行半定量分析，并對各半定量指標(biāo)間的相關(guān)性進(jìn)行分析，尋求活體內(nèi)獲得SPECT 報告基因表達(dá)顯像所需轉(zhuǎn)染病毒的最佳劑量及獲得最佳圖像質(zhì)量的時間過程。
　　 結(jié)果:
　　 1.重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定與本元正陽公司協(xié)作構(gòu)建的重組質(zhì)粒pDC316-tk 經(jīng)PCR、酶切鑒定和測序鑒定證明序列正確，包裝生成的重組腺病毒Ad5-tk的物理滴度（v.p./ml）為1.110 1

9、2，感染滴度（TCID50/ml）達(dá)到1.610 10。
　　 2.131 I-FIAU的標(biāo)記及質(zhì)量鑒定Iodogen 固相氧化法能有效標(biāo)記FAU；標(biāo)記產(chǎn)物用Sep-Pak C-18 反相層析色譜小柱進(jìn)行純化并測得的標(biāo)記率為(53.822.05)%(n=5)，TLC-SG 硅膠板薄層層析法測定標(biāo)記產(chǎn)物的放射化學(xué)純度為(94.851.76)%(n=5)，131 I-FIAU 在37 ℃血清中放置4h、12h和24h后的放射化學(xué)純度

10、大于90%。
　　 3.大鼠心肌報告基因表達(dá)的放射性自顯影結(jié)果從ARG圖像上可見，局部轉(zhuǎn)染Ad5-tk的大鼠前側(cè)壁心肌部位的131 I-FIAU 濃聚，非轉(zhuǎn)染部位和對照組心肌未見131 I-FIAU 濃聚。
　　 在第一組實驗中，局部心肌最高的放射性活性出現(xiàn)在第一天，隨著時間-放射性活性逐漸減弱。盡管HSV1-tk基因表達(dá)可見于甚至基因轉(zhuǎn)染后第7天，最佳的圖像質(zhì)量出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后的第1～2天。
　　 第二組實驗中，轉(zhuǎn)

11、染的心肌中131 I-FIAU 濃聚的水平呈典型的Ad 劑量依賴性。從ARG 分析和γ計數(shù)中可見，Ad5-tk的閾值為510 7 pfu，考慮病毒的免疫反應(yīng)，最佳的Ad5-tk 滴度為110 8 pfu。
　　 兩組實驗中均顯示ARG圖像上感興趣區(qū)（Region of interest，ROI）所得的半定量結(jié)果與體外的γ計數(shù)及RT-PCR 分析的mRNA 水平間存在較好的相關(guān)性（第一組時間因素相關(guān)系數(shù)分別為R 2=0.9899，

12、P<0.01和R 2=0.954，P<0.01；第二組滴度因素相關(guān)系數(shù)分別為R 2=0.9954，P<0.01和R 2=0.9621，P<0.01），γ計數(shù)和RT-PCR間亦存在較好的相關(guān)性（時間因素：R 2=0.9697，P<0.01；滴度因素：R 2=0.9508，P<0.01）。
　　 4.家兔心臟報告基因表達(dá)的SPECT 顯像SPECT圖像上可見轉(zhuǎn)染Ad5-tk 心肌前側(cè)壁部位131 I-FIAU的濃聚，而對照組顯示為本

13、底信號。RT-PCR和免疫組織化學(xué)分別在mRNA和蛋白水平證實了注射部位HSV1-tk基因的表達(dá)。
　　 第一組實驗中SPECT圖像上于轉(zhuǎn)染后的3天均可見局部心肌131 I-FIAU的濃聚，第四天時131 I-FIAU 濃聚較少，第五天時不見131 I-FIAU的濃聚。局部心肌的最高的放射性活性可見于6 h的圖像，然后隨著時間延長其活性逐漸下降。對于不同的病毒滴度，均可見轉(zhuǎn)染后1～2天圖像質(zhì)量最好。
　　 第二組實驗對不

14、同病毒滴度的研究中可見，轉(zhuǎn)染的心肌中131 I-FIAU 濃聚水平呈典型的Ad 劑量依賴性。從SPECT 分析和γ計數(shù)中可見，顯像的Ad5-tk 閾值為510 7 pfu,最佳滴度為1～510 8 pfu。半定量分析顯示，SPECT圖像上ROI的T/NT與體外γ計數(shù)的%ID/g 及RT-PCR 分析的mRNA 水平間存在較好的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)分別為R 2=0.933,P<0.01；R 2=0.877，P<0.01)。
　　 結(jié)論

15、:
　　 本研究證實了以腺病毒作為載體，HSV1-tk作為報告基因，放射性核素標(biāo)記FIAU作為報告探針心臟報告基因SPECT 顯像的可行性。SPECT圖像及ARG圖像上ROI的T/NT結(jié)果與體外的γ計數(shù)的%ID/g 及RT-PCR 分析的mRNA 水平間存在較好的相關(guān)性。顯像所需最佳的病毒滴度為1～510 8 pfu，最佳的顯像時間為基因轉(zhuǎn)染后1～2天。
　　 因此，HSV1-tk/FIAU 顯像心臟的轉(zhuǎn)基因表達(dá)是可行的