慢性缺氧和心肌駐留巨噬細(xì)胞在心肌細(xì)胞增殖中作用的研究.pdf

1、背景:據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，心血管疾病現(xiàn)已成為全球的頭號(hào)死因:全球每年死于心血管疾病的人數(shù)約占總死亡人數(shù)的31％。近來年，由于心肌梗死急性期的死亡率降低以及人口老齡化的原因，心力衰竭的全球發(fā)病率呈顯著上升趨勢。各種原因引起的心力衰竭因其顯著降低患者生存質(zhì)量、導(dǎo)致其反復(fù)入院治療，以及5年死亡率超過50％，故應(yīng)當(dāng)引起足夠重視，而其關(guān)鍵的病理生理學(xué)基礎(chǔ)是心肌細(xì)胞的不可再生性，而現(xiàn)有的治療措施均無法逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞的損耗帶來的影響，因此，亟待新的安全

2、而有效的治療策略。
　　促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖是唯一可以從本質(zhì)上補(bǔ)充心肌細(xì)胞損耗的治療策略，目前主要的方法包括外源性干細(xì)胞移植和內(nèi)源性促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖和內(nèi)源性促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。然而過去十年中嘗試了各種外源性干細(xì)胞移植到受損的心肌中，如間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、心肌祖細(xì)胞等，但均未能達(dá)到期望效果，尤其是在改善心肌相關(guān)功能的方面，并且具有潛在的成瘤性。
　　心肌細(xì)胞是心肌組織中承擔(dān)功能的主體細(xì)胞，研究表明，具有增殖分裂能

3、力的心肌細(xì)胞主要為單核的心肌細(xì)胞，而雙核或者多核的心肌細(xì)胞繼續(xù)分裂增殖的比例很小。而在人類的心肌細(xì)胞中，單核心肌細(xì)胞約占70％，因而具有極大的增殖潛力。因此，探尋內(nèi)源性促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的機(jī)制具有很好的前景。
　　近來研究發(fā)現(xiàn)了諸多相關(guān)分子以及信號(hào)通路在促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖方面的作用，但對引起哺乳動(dòng)物出生后心肌細(xì)胞很快退出細(xì)胞周期的原因還尚不明確，尤其是引起這一改變的關(guān)鍵上游影響因素。內(nèi)環(huán)境的低氧分壓狀態(tài)是具有心肌組織再生潛能的物種的共

4、有特征之一，如斑馬魚和蠑螈等，而哺乳動(dòng)物在出生前的子宮內(nèi)生長階段同樣處于內(nèi)環(huán)境相對低氧分壓狀態(tài)，胎兒臍動(dòng)脈血氧飽和度只有80％至90％，氧分壓約為32至35mmHg，而左室內(nèi)血氧飽和度約為65％，氧分壓約為25至28mmHg。出生后隨著體肺循環(huán)的分別建立，內(nèi)環(huán)境迅速脫離低氧分壓狀態(tài)，動(dòng)脈血氧分壓從30mmHg升高至100mmHg，而幾乎與此同時(shí)心肌細(xì)胞也逐漸退出細(xì)胞周期，失去增殖與再生的能力。因此，缺氧這一上游因素對于心肌細(xì)胞增殖的影響

5、值得深入研究。
　　在心肌缺血梗死后的組織修復(fù)過程中，死亡細(xì)胞以及梗死區(qū)組織碎片的清除主要依賴于損傷激活的局部免疫反應(yīng)，而巨噬細(xì)胞在這一過程中發(fā)揮著主要作用。巨噬細(xì)胞具有極強(qiáng)的功能多樣性，是造血系統(tǒng)中最具可塑性的細(xì)胞。在器官發(fā)育、穩(wěn)態(tài)，以及組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞按其功能可分為促進(jìn)炎癥的M1型巨噬細(xì)胞和抑制炎癥的M2型巨噬細(xì)胞;按其來源可分為胚胎來源駐留巨噬細(xì)胞和骨髓單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞。近期有研究發(fā)現(xiàn)耗竭巨噬細(xì)胞后，新

6、生小鼠在心尖切除后無法通過心肌細(xì)胞增殖的途徑修復(fù)損傷部位，說明巨噬細(xì)胞在心肌細(xì)胞增殖再生過程發(fā)揮重要作用;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)心肌組織中不同的巨噬細(xì)胞亞型發(fā)揮截然不同的作用，在新生小鼠心肌損傷后心肌胚胎來源駐留巨噬細(xì)胞明顯增多，而在成年小鼠心肌損傷后明顯增多的則為骨髓單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞。而且另有研究指出出生后伴隨著年齡的增長，心肌胚胎來源駐留巨噬細(xì)胞比例以及增殖活性逐漸下降、凋亡比例隨之升高，而骨髓來源的巨噬細(xì)胞則逐漸成為心肌中主要的巨噬

7、細(xì)胞亞型。因此，巨噬細(xì)胞，尤其是心肌組織中胚胎來源駐留巨噬細(xì)胞對心肌細(xì)胞增殖的影響仍然值得繼續(xù)研究。
　　目的和內(nèi)容:本課題希望通過探尋促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖再生的因素和機(jī)制，為臨床治療心肌細(xì)胞損傷為特征的心臟疾病提供新的治療思路和治療策略。
　　實(shí)驗(yàn)通過檢測紫紺型先心病與非紫紺型先心病心肌組織的心肌細(xì)胞增殖現(xiàn)象，探究出生后內(nèi)環(huán)境缺氧對人心肌細(xì)胞增殖的影響。通過建立常壓缺氧小鼠模型進(jìn)一步驗(yàn)證缺氧是否具有促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的作用，并檢

8、測缺氧對心肌巨噬細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞亞型有無改變。通過缺氧刺激離體乳鼠原代心肌細(xì)胞觀察單獨(dú)對心肌細(xì)胞缺氧對心肌細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)采用CCR2抑制劑增加心肌組織中胚胎來源駐留巨噬細(xì)胞比例，探究巨噬細(xì)胞亞型改變對心肌細(xì)胞增殖的影響。
　　方法:
　　1、在人類心肌組織中檢測缺氧對心肌細(xì)胞增殖的影響:
　　收集紫紺型先心病患者與非紫紺型先心病患者心肌組織，心肌組織主要取自于梗阻的右室流出道處。紫紺型先心病組主要由法洛四聯(lián)癥患者

9、與右室雙出口患者組成，非紫紺型先心病組主要由右室流出道梗阻患者以及右室流出道梗阻合并室間隔缺損患者組成。按年齡層次分組為小于5歲、5至16歲，以及大于16歲。心肌組織標(biāo)本行免疫熒光檢測pH3以及Aurora B在心肌細(xì)胞的共表達(dá)以評估心肌細(xì)胞增殖水平;通過WGA染色檢測心肌細(xì)胞肥大水平;通過標(biāo)記c-Kit檢測是否存在心肌干細(xì)胞或心肌祖細(xì)胞從而影響心肌細(xì)胞增殖水平。
　　2、用C57BL/6新生小鼠進(jìn)一步驗(yàn)證缺氧對心肌細(xì)胞增殖的作用

10、:
　　實(shí)驗(yàn)以C57BL/6小鼠為研究對象，建立常壓缺氧動(dòng)物模型。隨機(jī)將新生小鼠分為常氧組和缺氧組:常氧組為標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下氮?dú)鉂舛?9％、氧氣濃度21％和23℃環(huán)境下飼養(yǎng)，缺氧組為標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下氮?dú)鉂舛?5％、氧氣濃度15％和23℃環(huán)境下飼養(yǎng)。新生小鼠分別于出生后第3天、第6天、第10天取心臟，通過檢測心肌細(xì)胞pH3、Aurora B共表達(dá)反映心肌細(xì)胞增殖水平。按上述方法對成年小鼠進(jìn)行4周缺氧處理后取心臟，檢測缺氧對成年大鼠心肌細(xì)胞增

11、殖水平的影響。
　　3、檢測缺氧處理后小鼠在體心肌巨噬細(xì)胞亞型構(gòu)成比例的變化:
　　取出生后第3天、第6天、第10天缺氧組和常氧組小鼠心肌組織，消化為單細(xì)胞懸液，用抗CD45、Ly-6G、F4/80、MHC-Ⅱ以及CCR2熒光直標(biāo)抗體標(biāo)記細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞水平以及巨噬細(xì)胞亞型在缺氧條件下的改變。
　　4、缺氧刺激乳鼠原代心肌細(xì)胞觀察單獨(dú)對心肌細(xì)胞缺氧對心肌細(xì)胞增殖的影響:
　　分離大鼠原代心肌細(xì)胞體

12、外培養(yǎng)，隨機(jī)分為缺氧組與對照組，為模擬生理?xiàng)l件下內(nèi)環(huán)境氧分壓狀態(tài)，缺氧組為氧氣濃度1％（氧分壓1kPa）處理，常氧組為氧氣濃度5％（氧分壓5kPa）處理，二氧化碳濃度均為5％，37℃培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，通過免疫熒光染色觀察pH3在心肌細(xì)胞核的表達(dá)檢測體外心肌細(xì)胞增殖水平。
　　5、改變巨噬細(xì)胞亞型比例觀察巨噬細(xì)胞對心肌細(xì)胞增殖的作用:
　　將C57BL/6新生小鼠隨機(jī)分為CCR2抑制劑組和對照組，實(shí)驗(yàn)組新生小鼠

13、從出生后第1天開始于背部皮下注射CCR2抑制劑，每天一次，用量為4mg/kg;對照組注射等量不含CCR2抑制劑的溶劑。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下、79％氮?dú)狻?1％氧氣以及23℃環(huán)境中飼養(yǎng)，分別于出生后第3天、第6天、第10天取心臟行流式細(xì)胞分析，觀察巨噬細(xì)胞改變情況;免疫熒光檢測pH3和Aurora B陽性心肌細(xì)胞所占整體心肌細(xì)胞比例情況以評估心肌細(xì)胞增殖水平。
　　6、統(tǒng)計(jì)分析
　　采用GraphPad Prism6.0軟件

14、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)采用mean±SEM表示，采用非配對t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，p＜0.05認(rèn)為兩組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　1、慢性缺氧時(shí)人心肌細(xì)胞增殖能力的實(shí)驗(yàn)研究。
　　(1)人類心肌組織冰凍切片免疫熒光結(jié)果顯示，在紫紺型先心病組嬰幼兒心肌標(biāo)本和非紫紺型先心病組嬰幼兒心肌標(biāo)本中，pH3和Aurora B表達(dá)陽性的心肌細(xì)胞比例存在顯著差異:紫紺型先心病組心肌標(biāo)本中pH3陽性心肌細(xì)胞比例約為非紫紺型先心病組的1

15、0倍(p＜0.001)，并且前者Aurora B陽性心肌細(xì)胞比例約為后者的7倍(p＜0.05)。而5至16歲組和大于16歲組中紫紺型先心病和非紫紺型先心病心肌組織中心肌細(xì)胞增殖水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明缺氧可以維持人類出生后的心肌細(xì)胞增殖能力。
　　(2) WGA染色顯示紫紺型先心病心肌標(biāo)本與非紫紺型先心病心肌標(biāo)本在小于5歲組心肌肥大水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)，在5至16歲組和大于16歲組中紫紺型先心病心肌標(biāo)本較非紫紺型先心病心

16、肌細(xì)胞面積明顯增大(p＜0.05)。這一差異可能由長期較高的心臟負(fù)荷造成，而嬰幼兒心臟負(fù)荷較成人偏低，而且持續(xù)時(shí)間短，與對照組相比尚未出現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的表型。而這一點(diǎn)也反映出嬰幼兒心肌細(xì)胞增殖現(xiàn)象并非由心肌肥大引起。
　　(3)免疫熒光檢測c-Kit陽性心肌細(xì)胞顯示，在紫紺型先心病和非紫紺型先心病心肌組織標(biāo)本中均未發(fā)現(xiàn)c-kit陽性心肌細(xì)胞。表明心肌細(xì)胞增殖水平差異與心肌干細(xì)胞或心肌祖細(xì)胞無關(guān)。
　　2、慢性缺氧對小鼠在體

17、和離體心肌細(xì)胞增殖能力調(diào)節(jié)的研究。
　　(1)新生小鼠缺氧處理后較常氧組比較可觀察到明顯的心肌細(xì)胞增殖現(xiàn)象，缺氧組新生小鼠心肌中pH3陽性心肌細(xì)胞比例約為常氧組的2.5倍(p＜0.001)，Aurora B陽性心肌細(xì)胞比例約為常氧組的2.2倍(p＜0.05)，驗(yàn)證了缺氧對于維持出生后心肌細(xì)胞增殖能力的作用。而對于成年小鼠，缺氧組較常氧組并不能增加心肌細(xì)胞增殖水平(p＞0.05)，表明缺氧可以延長出生后心肌細(xì)胞增殖的時(shí)間窗、延遲心肌

18、細(xì)胞退出細(xì)胞周期的時(shí)間。
　　(2)體外培養(yǎng)培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)缺氧組與常氧組心肌細(xì)胞增殖水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。表明單純對心肌細(xì)胞缺氧并不能促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，缺氧維持心肌細(xì)胞增殖能力依賴于缺氧對心肌細(xì)胞所處內(nèi)環(huán)境的改變。
　　3、慢性缺氧對心肌駐留巨噬細(xì)胞增殖及不同巨噬細(xì)胞亞型構(gòu)成改變的調(diào)節(jié)
　　流式細(xì)胞術(shù)分析顯示兩組的巨噬細(xì)胞總體變化沒有明顯差異，但缺氧組新生小鼠心肌組織中胚胎來源駐留巨噬細(xì)胞比例較常氧

19、組明顯增加(p＜0.01)，并且出生后心肌胚胎來源駐留巨噬細(xì)胞比例呈緩慢下降趨勢，在出生后6天內(nèi)缺氧組心肌胚胎來源駐留巨噬細(xì)胞比例較常氧組存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)，但這種差異隨出生后時(shí)間逐漸縮小，在第10天以后差異失去統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明缺氧可以改變出生后心肌巨噬細(xì)胞亞型的構(gòu)成，增加心肌駐留巨噬細(xì)胞比例。
　　4、心肌駐留巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖能力機(jī)制的初步研究
　　(1)流式細(xì)胞術(shù)檢測CCR2抑制劑組和對照組心肌巨

20、噬細(xì)胞后顯示，在使用CCR2抑制劑期間心肌中胚胎來源駐留巨噬細(xì)胞比例明顯增加(p＜0.01)。表明CCR2抑制劑可以有效改變心肌巨噬細(xì)胞亞型構(gòu)成，增加心肌胚胎來源駐留巨噬細(xì)胞比例。
　　(2)心肌組織冰凍切片免疫熒光結(jié)果顯示，CCR2抑制劑組pH3陽性心肌細(xì)胞比例較對照組顯著增加(p＜0.001)，約為對照組的3.5倍;Aurora B陽性心肌細(xì)胞比例約為對照組的2.6倍(p＜0.05)。表明增加心肌胚胎來源駐留巨噬細(xì)胞可以有效維