小鼠CCR7重組腺病毒轉(zhuǎn)染未成熟樹突狀細(xì)胞的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的: 臨床上同種異體皮膚移植是目前大面積深度燒傷患者早期創(chuàng)面覆蓋最直接、有效的治療方法，但是由于皮膚的強烈抗原特性，導(dǎo)致移植后3周左右外源皮膚就會發(fā)生不可逆的排斥反應(yīng)，極大抑制了自體微粒皮混合大張異體皮移植效果。如何成功誘導(dǎo)出皮膚移植后的免疫耐受，臨床上至今未發(fā)現(xiàn)有效的措施。樹突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)是目前已知的功能最強大的專職抗原提呈細(xì)胞，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮了極其重要的作用。DC的分化發(fā)育過程伴隨

2、著DC由未成熟的前體細(xì)胞分化發(fā)育為成熟細(xì)胞，細(xì)胞的形態(tài)、表面標(biāo)志以及生物學(xué)功能等都發(fā)生了相應(yīng)變化。作為DC未成熟的形式-imDC(immaturedendriticcell)因為其功能上最顯著的特點就是可以誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的特異性低應(yīng)答而成為當(dāng)前研究免疫耐受策略的熱點，這在我們上一個國家自然科學(xué)基金項目(N0.30271341)中也得到證實。利用imDC或者基因修飾DC進(jìn)行的聯(lián)合移植實驗已經(jīng)在腎、肝、心臟、胰腺和小腸等器官中取得了令人較為

3、滿意的效果，這為皮膚移植實驗提供了非常有利的依據(jù)。 DC的發(fā)育成熟過程伴隨著其表型的變化，包括攝取能力減弱和MHC類分子、共刺激分子的表達(dá)上調(diào)，最終變成強大的抗原提呈細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)imDC在炎性介質(zhì)作用下逐漸遷移成熟的過程中，其表面趨化因子受體7(Chemokinereceptor-7，CCR7)表達(dá)上調(diào)。通過CCR7與其配體MIP3β(即CCL19)和SLC(即CCL21)的相互作用，引導(dǎo)DC趨化遷移至淋巴結(jié)，由此CCR7被認(rèn)

4、為是成熟DC(matureDC，mDC)遷移歸巢完成抗原遞呈從而激活初始T細(xì)胞的主要受體之一。目前CCR7趨化遷移的能力在部分惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移中得到證實，表明CCR7嚴(yán)格調(diào)控了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞這種非隨機的、有組織器官選擇性的轉(zhuǎn)移過程類似于免疫刺激過程中樹突狀細(xì)胞的定向遷移。基于CCR7具有非常重要的趨化遷移功能，若DC成熟度越高，CCR7表達(dá)更強，則免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)更為強勁的免疫應(yīng)答，反之則誘導(dǎo)免疫耐受，然而，imDC由于缺乏CCR7

5、的表達(dá)，向淋巴結(jié)的趨化遷移特性較弱，長時間處于非T細(xì)胞區(qū)易受各種炎癥因子或者外來抗原的刺激而發(fā)育為mDC，嚴(yán)重影響其誘導(dǎo)免疫耐受的效果。 基于以上分析，本研究擬在國家自然科學(xué)基金的資助下，通過構(gòu)建含有小鼠CCR7的重組腺病毒，嘗試在imDC上建立CCR7的表達(dá)，使imDC獲得原本mDC才具有的高效遷移能力，避免imDC在外周組織向成熟狀態(tài)的分化，有效地確保其誘導(dǎo)免疫耐受功能的發(fā)揮，為臨床上大面積深度燒傷患者早期創(chuàng)面覆蓋引起的免疫

6、排斥提供新的解決方法和思路。 方法: 1、提取小鼠胸腺總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法，以自行設(shè)計的帶有酶切位點的引物，擴增獲得CCR7基因全部序列，經(jīng)過T-A克隆，酶切亞克隆到穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV上，在BJ5183菌內(nèi)和pAdeasy-1同源重組，篩選陽性克隆，酶切鑒定，線性化后脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行包裝、PCR鑒定及擴增，得到含有CCR7基因的重組腺病毒，并根據(jù)報告基因GFP測定病

7、毒滴度。 2、小劑量rmGM-CSF和rmIL-4聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)BALB/c小鼠骨髓來源的imDC，光鏡下觀察并于第6天收獲；將上述構(gòu)建的重組腺病毒轉(zhuǎn)染imDC，根據(jù)報告基因綠色熒光蛋白(greenfluorescenceprotein，GFP)，檢測重組腺病毒的感染效率；以空病毒為對照，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)和免疫印跡(westernblot)法，檢測轉(zhuǎn)染3天后imDC上CCR7基因在mRSA及蛋白水平表達(dá)的變化。 結(jié)果:

8、 1、成功構(gòu)建了小鼠CCR7重組腺病毒載體，重組腺病毒滴度可達(dá)1×109U/ml。 2、培養(yǎng)的imDC疏松貼壁生長，表面可見不規(guī)則的樹枝狀突起，體積較前增大；熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染腺病毒的細(xì)胞膜表面染有綠色熒光，呈明顯的不規(guī)則的毛刺樣突起。 3、重組腺病毒轉(zhuǎn)染imDC后，感染效率可達(dá)70％，CCR7在mRNA及蛋白表達(dá)上與空病毒組相比明顯增高。 結(jié)論: 1、成功構(gòu)建小鼠CCR7基因重組腺病毒載體。獲

9、得了高滴度的重組腺病毒。 2、小鼠骨髓來源的單核細(xì)胞在應(yīng)用低劑量rmGM-CSF和rmIL-4聯(lián)合刺激誘導(dǎo)后獲得具有典型形態(tài)特征的imDC。 3、構(gòu)建的重組腺病毒感染imDC后，CCR7的mRNA及蛋白表達(dá)明顯增高，成功地在imDC上建立了CCR7的表達(dá)，并再次證明所構(gòu)建的腺病毒載體方法正確，轉(zhuǎn)染效率高，能夠有效表達(dá)目的基因，具有較高的感染力。這為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)染CCR7的imDC的趨化遷移功能改變及其誘導(dǎo)皮膚移植免疫耐受