沉默CCR7基因后對樹突狀細胞在體外成熟影響的研究.pdf

1、目的和意義：近年來，諸多研究表明免疫炎癥反應參與冠心病的發(fā)病機制，而作為免疫炎癥反應中最為重要的抗原提呈細胞-樹突狀細胞(DendriticCells，DCs)在免疫反應中發(fā)揮著重要的作用。由于趨化因子受體CCR7在未成熟的樹突狀細胞(Immaturedendriticcells，imDCs)表面低表達，而在成熟的樹突狀細胞表面高表達，推測CCR7可能與DCs的成熟有著密切的關系。另外在免疫反應的過程中imDC主要起著攝取抗原的作用，成

2、熟的DCs將攝取抗原呈遞給T淋巴細胞引起免疫炎癥反應。CCR7能否調控DCs的成熟目前尚不清楚。本文通過體外原代分離培養(yǎng)大鼠骨髓源性樹突狀細胞(RatBoneMarrow-derivedDendriticCells，BMDCs)，進一步通過形態(tài)學及其細胞表型進行鑒定。同時構建趨化因子受體CCR7的RNA干擾的慢病毒載體，進一步轉染imDCs；轉染6天后，通過RT-PCR和WesternBlot分別檢測CCR7mRNA和蛋白的表達以及EL

3、ISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中巨噬細胞炎性蛋白1a(MIP-1a)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的含量(由于相關研究表明隨著DCs的成熟培養(yǎng)上清液中MIP-1a分泌是逐漸降低的，MCP-1分泌是逐漸增高的)。探討沉默CCR7基因后對DCs成熟的影響，從而通過抑制DCs的成熟為動脈粥樣硬化性心臟病乃至于心血管疾病的治療提供新的思路。
　　 方法：體外分離培養(yǎng)及其鑒定大鼠骨髓源性樹突狀細胞：取出150-180g(雌雄不限)SD大

4、鼠雙下肢股骨和脛骨，用5ml注射器吸取含10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗骨髓腔收集骨髓細胞，繼而用粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，GM-CSF)5ng/ml和白細胞介素-4(Interleukin4，IL-4)5ng/ml誘導分化，培養(yǎng)至第6天收集懸浮細胞(即imDCs)，繼續(xù)用GM-CSF2.5-5ng/ml進行分化培養(yǎng)，一般至12天可

5、獲得成熟的樹突狀細胞。分別收集第6天、9天、12天及14天BMDCs，通過形態(tài)學及流式細胞儀檢測細胞表型對BMDCs進行鑒定。由吉凱公司完成RNA干擾慢病毒載體構建和慢病毒包裝與滴度的檢測，獲得4個靶點的shRNA，通過RT-PCR檢測mRNA和WesternBlot檢測蛋白篩選最佳的靶點。本研究分為3個組：實驗組為轉染CCR7-GFP-LV的DCs、陰性對照組為轉染NC-GFP-LV的DCs，空白對照組為正常培養(yǎng)的DCs。用篩選出最佳

6、的靶點CCR7-GFP-LV轉染第6天的樹突狀細胞，穩(wěn)定轉染6天后通過RT-PCR和WesternBlot檢測各組CCR7mRNA和蛋白的表達水平，通過ELISA法檢測三個組細胞培養(yǎng)上清液中MIP-1a和MCP-1的含量，通過MTT法檢測CCR7沉默后對DCs生長增殖情況的影響。
　　 結果：體外培養(yǎng)初期(6-9天)樹突狀細胞呈半懸浮狀態(tài)，圓形，無樹突；培養(yǎng)至后期(12天左右)呈半懸浮半貼壁狀態(tài)，圓形或橢圓形，部分細胞可見樹突狀

7、突起。流式細胞表型的鑒定結果示培養(yǎng)初期低表達CD86，中度表達MHC-Ⅱ，至培養(yǎng)后期CD86和MHC-Ⅱ的表達均增高。ELISA檢測結果示隨著培養(yǎng)時間的延長MIP-1a含量逐漸降低，而MCP-1含量逐漸增高。由吉凱公司提供4個靶點，經過RT-PCR和WesternBlot篩選出最佳靶點為CCR7-RNAi-LV3＃，其濃縮病毒滴度為6x108TU/ml.轉染CCR7shRNA慢病毒轉染后6天(第12天DCs)，70-75％左右的BMDC

8、s表達GFP，RT-PCR結果顯示CCR7mRNA表達情況實驗組(26.85±0.03)％與空白對照組(93.01±0.01)％和陰性對照組(83.69±0.01)％相比P<0.05，具有統(tǒng)計學意義；WesternBlot結果示：CCR7蛋白表達情況實驗組(47.86±0.02)％與空白對照組(93.50±0.05)％和陰性對照組(91.35±0.02)％相比P<0.05，具有統(tǒng)計學意義；ELISA結果顯示MIP-1a含量實驗組(30.

9、70±0.50)pg/ml與空白對照組(25.33±1.74)pg/ml和陰性對照組(26.95±0.22)pg/ml相比P<0.05，具有統(tǒng)計學意義；MCP-1含量實驗組(25.50±0.95)pg/ml與空白對照組(31.06±1.41)pg/ml和陰性對照組(31.44+1.95)pg/ml相比P<0.05，具有統(tǒng)計學意義；MTT結果示：CCR7沉默后實驗組與空白對照組和陰性對照組相比P<0.05，具有統(tǒng)計學意義。