未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)及生物免疫學(xué)功能研究.pdf

1、目的：建立一種簡(jiǎn)便實(shí)用的體外培養(yǎng)未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的方法，并鑒定和研究其形態(tài)、表型以及生物免疫學(xué)功能。觀察不同成熟狀態(tài)的樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞功能的影響，探討未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受中的作用，為樹(shù)突狀細(xì)胞在降低移植免疫排斥反應(yīng)和治療某些自身免疫性疾病的臨床應(yīng)用提供一些理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.小鼠骨髓源樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)；取小鼠的骨髓細(xì)胞作為樹(shù)突狀細(xì)胞的前體細(xì)胞，利用細(xì)胞因子rmGM-CSF和IL-4聯(lián)合刺

2、激，手法篩選樹(shù)突狀細(xì)胞集落，培養(yǎng)6天后收集疏松貼壁細(xì)胞，即為小鼠骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞。將培養(yǎng)的樹(shù)突狀細(xì)胞分成兩組，一組在培養(yǎng)結(jié)束前18h加入LPS刺激其成熟(以下稱(chēng)成熟DC組)；一組不加入LPS刺激，使其保留未成熟樹(shù)突狀從不特性(以下稱(chēng)未成熟DC組)。 2.樹(shù)突狀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察在光鏡、電鏡下觀察兩組細(xì)胞的形態(tài)，比較成熟組樹(shù)突狀細(xì)胞與未成熟組樹(shù)突狀細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的差別。 3.樹(shù)突狀細(xì)胞的表型測(cè)定；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞

3、表面標(biāo)志，檢測(cè)小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞的特異性標(biāo)志CD11c評(píng)估樹(shù)突狀細(xì)胞純度；檢測(cè)MHC-Ⅱ類(lèi)分子以及共刺激分子評(píng)價(jià)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟度。 4.樹(shù)突狀細(xì)胞分泌IL-12的水平測(cè)定；收集兩組樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)上清，用ELISA法檢測(cè)上清中IL-12的表達(dá)水平，了解樹(shù)突狀細(xì)胞分泌IL-12的水平與其成1熟度的關(guān)系。 5.檢測(cè)樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞功能的影響；將兩組的樹(shù)突狀細(xì)胞分別與同種異型T細(xì)胞共培養(yǎng)后，進(jìn)行同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)：通過(guò)

4、每分鐘刺激指數(shù)(cpm)來(lái)衡量樹(shù)突狀細(xì)胞刺激T細(xì)胞增殖的能力；用液相芯片技術(shù)檢測(cè)MLR上清中的Th1類(lèi)細(xì)胞因子和Th2細(xì)胞因子的表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例，以觀察兩組樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞功能的不同影響。 結(jié)論： 1.利用GM-CSF聯(lián)合IL-4刺激小鼠骨髓前體細(xì)胞，并通過(guò)手法篩選初步純化，能得到大量純度較高的樹(shù)突狀細(xì)胞，是一種簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)的樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)方法，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。 2.建立了判斷樹(shù)突

5、狀細(xì)胞成熟狀態(tài)的指標(biāo)體系，包括樹(shù)突狀細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞表型、樹(shù)突狀細(xì)胞分泌IL-12的表達(dá)水平和樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的影響等(T細(xì)胞的增殖能力、T細(xì)胞分泌Th1/Th2細(xì)胞因子偏倚情況和CD4+CD25+T細(xì)胞產(chǎn)生的比例)。 3.未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞主要生物學(xué)特性體現(xiàn)在，細(xì)胞表面中度表達(dá)MHC分子；低水平表達(dá)共刺激分子；在體外少量分泌IL-12；刺激T細(xì)胞分泌以Th2為主導(dǎo)的細(xì)胞因子；誘導(dǎo)T細(xì)胞低反應(yīng)或產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，初步揭示了未成熟