慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠整合位點(diǎn)研究.pdf

1、慢病毒載體整合到宿主細(xì)胞的染色體上可以長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，目前已成為基因治療和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物載體研究的熱點(diǎn)。慢病毒載體整合的位置效應(yīng)是影響外源基因表達(dá)的重要因素，慢病毒載體整合位點(diǎn)的研究是探索外源基因整合機(jī)制的手段之一。 本研究系統(tǒng)地培育了FUGW（flap-Ub promoter-GFP-WRE）慢病毒轉(zhuǎn)基因小鼠家系，并通過(guò)PCR方法篩選攜帶外源基因的慢病毒轉(zhuǎn)基因小鼠。本研究利用定量PCR技術(shù)檢測(cè)外源基因在FUGW轉(zhuǎn)基因小鼠后代中的拷

2、貝數(shù)。同時(shí)應(yīng)用熒光活化細(xì)胞揀選（fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）檢測(cè)外源基因eGFP在FUGW轉(zhuǎn)基因小鼠后代中的表達(dá)。通過(guò)分析FUGW轉(zhuǎn)基因后代小鼠外源基因的表達(dá)和拷貝數(shù)，篩選出不同表達(dá)水平的單整合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因小鼠。 對(duì)于篩選得到的單整合位點(diǎn)的FUGW轉(zhuǎn)基因小鼠，應(yīng)用反向PCR（Inverse PCR）和接頭PCR（Adopter PCR）技術(shù)定位FUGW轉(zhuǎn)基因小鼠整合位點(diǎn)的基

3、因組位置。同時(shí)應(yīng)用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)定位整合位點(diǎn)的染色體位置作為驗(yàn)證。結(jié)合FUGW轉(zhuǎn)基因后代小鼠外源基因的表達(dá)情況，分析慢病毒載體整合位點(diǎn)與外源基因表達(dá)之間的聯(lián)系。 另外，本研究從轉(zhuǎn)基因插入對(duì)宿主基因表達(dá)的影響入手，分析了外源基因在不同臟器中表達(dá)水平與整合的位點(diǎn)和臟器的關(guān)系，最終發(fā)現(xiàn)外源基因的表達(dá)水平主要受到該整合位點(diǎn)的狀況的影響，同時(shí)外源基因的插