慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi抑制牛整聯(lián)蛋白亞基αV基因表達的研究.pdf

1、受體在病毒與宿主細胞的相互作用過程中起著極為重要的作用。口蹄疫病毒感染宿主細胞的第一步是病毒識別并結(jié)合存在于宿主細胞表面的受體，然后在受體的介導(dǎo)下，病毒才能夠進入宿主細胞并在其中完成核酸的復(fù)制及病毒粒子的裝配。整聯(lián)蛋白是一類由α亞基和β亞基以非共價鍵結(jié)合形成的異源二聚體跨膜糖蛋白，能介導(dǎo)細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)之間的相互作用，在細胞的增殖、分化、移行、生長等許多方面發(fā)揮重要作用。該蛋白家族擁有24個蛋白成員，其中，αvβ1、αvβ3

2、、αvβ6、αvβ8是目前公認的FMDV的受體，這四種整聯(lián)蛋白擁有一個共同的亞基αv。RNAi是由雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特異性RNA降解作用。它通過雙鏈RNA的介導(dǎo)，特異性阻抑相關(guān)基因的表達，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。慢病毒載體是理想的真核細胞基因轉(zhuǎn)移工具，被廣泛應(yīng)用于相關(guān)的RNAi研究領(lǐng)域，例如抗病毒研究、遺傳性疾病的治療、基因治療。利用慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并整合宿主基因組的特性可以使設(shè)計好的RNA干擾片段在目的細胞系中持續(xù)表達，達到

3、對靶基因持續(xù)干擾的效果。
　　 本實驗根據(jù)本課題組以前克隆的牛源整聯(lián)蛋白αv基因(Genban登錄號：DQ871215)，按照siRNA設(shè)計原則，運用在線siKNA設(shè)計軟件設(shè)計3個針對integrin-αv的siRNA靶點序列αv-2270、αv-1716、αv-483和一個siRNA陰性對照si0。運用實時熒光定量PCR技術(shù)篩選出高效的干擾片段αv-483，將αv-483的核苷酸序列交由生物公司合成其對應(yīng)的雙鏈cDNA，雙鏈c

4、DNA通過定向克隆連接至U6進入載體(U6 entry vector)，構(gòu)建出進入載體U6-αv483，U6-αv483與pLenti6/BLOCK-iTTM載.體系統(tǒng)中的表達質(zhì)粒通過LR同源重組反應(yīng)形成表達載體DEST-αv483。在生長狀態(tài)良好的20代次之內(nèi)的293FT細胞中，轉(zhuǎn)染DEST-αv483及包裝Mix中的三個包裝質(zhì)粒pLP1，pLP2和pLP/VSVG，72h之后收集慢病毒液，命名為plenti6/αv483。用pk-1

5、5進行慢病毒滴度的測定，結(jié)果顯示plenti6/αv483的滴度為14.2×10-6TU/ml，達到了轉(zhuǎn)染細胞所需的滴度要求。用plenti6/αv483來轉(zhuǎn)染牛腎細胞MDBK，在殺稻瘟菌素的抗性壓力之下篩選出了四株單克隆的陽性細胞系，分別為1B8、1F5、289、2E6。經(jīng)核酸水平的實時熒光定量PCR和細胞水平的cell-ELISA及間接免疫熒光實驗鑒定，四株細胞系中整聯(lián)蛋白的表達量均有不同程度的下降，其中1F5細胞株中整聯(lián)蛋白表達量