卵巢癌上清誘導(dǎo)成熟樹(shù)突狀細(xì)胞亞群漂移的體外研究.pdf

1、背景： 樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是目前發(fā)現(xiàn)的效能最高的專職性抗原提呈細(xì)胞，其功能多樣，但其最大的功能就是能夠刺激初始T細(xì)胞的增殖。DC能有效地內(nèi)化、加工和遞呈可溶性抗原，激發(fā)T細(xì)胞增殖生成輔助性T細(xì)胞和殺傷性T細(xì)胞并能特異性的激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞，引起免疫應(yīng)答。DC根據(jù)其來(lái)源可分為髓系來(lái)源的DC(DC1)和淋巴系來(lái)源的DC(DC2)。DC1的功能與其成熟狀態(tài)密切相關(guān)，成熟DC1具有很強(qiáng)的將抗原肽提呈給未致敏的T淋巴細(xì)胞并使其活化的能力，

2、在腫瘤免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。而未成熟DC1具有很強(qiáng)的攝取處理抗原的能力，被稱為免疫哨兵，但其抗原提呈能力很差，往往維持穩(wěn)態(tài)環(huán)境中的免疫耐受。DC2受抗原刺激后分泌大量IFN-α，誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th2方向分化，分泌Th2型細(xì)胞因子。DC2不是T細(xì)胞的有效刺激者，再次給予異體抗原后在體內(nèi)外可誘導(dǎo)非特異性低反應(yīng)性，誘導(dǎo)T細(xì)胞的免疫耐受，所以又稱之為調(diào)節(jié)性DC。 腫瘤患者體內(nèi)DC功能大多存在缺陷，一些腫瘤衍生因子的存在，如VEGF、M-C

3、SF、IL-6)和GM-CSF等使DC分化成熟障礙是其主要原因，致使有功能的成熟DC比例下降，不成熟DC大量積累。但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內(nèi)DC功能缺陷與外周血中DC1/DC2比例失衡有關(guān)，稱之為DC亞群漂移學(xué)說(shuō)。 卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤，腹腔內(nèi)廣泛播散是其主要的生物學(xué)行為和致死原因。已有研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者體內(nèi)也存在這種DC亞群漂移現(xiàn)象，而我們先前研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌腹水中存在Th1向Th2漂移，癌組織中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(

4、TIL)和腹水中腫瘤相關(guān)淋巴細(xì)胞(TAL)的腫瘤殺傷力顯著下降，提示卵巢癌患者的腹腔免疫存在缺陷，且發(fā)現(xiàn)腹腔免疫缺陷先于其全身免疫缺陷發(fā)生，據(jù)此我們猜測(cè)卵巢癌細(xì)胞可能分泌某些物質(zhì)而導(dǎo)致DC亞群漂移。因此本研究以健康人外周血白細(xì)胞來(lái)源的CDl4s細(xì)胞在體外誘導(dǎo)成的成熟DC為研究對(duì)象，用兩種卵巢癌細(xì)胞株細(xì)胞培養(yǎng)上清與DC共同培養(yǎng)，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面成熟標(biāo)記和DC1/DC2的比例的變化，通過(guò)DC與CD3陽(yáng)性T細(xì)胞共同培養(yǎng)，觀察卵巢癌上

5、清作用前后DC刺激T細(xì)胞的功能變化，證明卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清是否能使健康人外周血來(lái)源的成熟DC1向DC2漂移及引發(fā)DC功能障礙，從而為探索卵巢癌免疫治療新方法奠定理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的觀察兩種卵巢癌上清對(duì)健康人外周血單核細(xì)胞來(lái)源的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞亞型和功能的影響，以進(jìn)一步揭示腫瘤的免疫逃逸機(jī)制。 材料與方法： 采用健康人外周血白細(xì)胞液，體外梯度密度離心分離出單核細(xì)胞層，磁珠分選得到CD14單個(gè)核細(xì)胞，加入IL-4，GM-C

6、SF五天誘導(dǎo)成為未成熟DC，再加入TNF-α兩天誘導(dǎo)成為成熟DC，將預(yù)先準(zhǔn)備好的兩種卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清(SKOV3，3AO)分別與上述DC共培養(yǎng)兩天，采用流式細(xì)胞術(shù)觀察腫瘤細(xì)胞上清對(duì)DC亞型，表面成熟標(biāo)記表達(dá)的影響；采用同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Brdu-Elisa)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞上清對(duì)DC功能的影響。 結(jié)果： 1.體外誘導(dǎo)獲得具有典型毛刺狀突起的成熟DC，其中DC1的比例約(70-90)％，DC2比例小于2％，表面．HL

7、A-DR及成熟標(biāo)記CD80,CD86都有高表達(dá)。 2.SKOV3上清作用后DC1的比例為(70.46±5.72)％，與對(duì)照相(80.96± 3.65)％比，有了明顯的下降(P<0.05): DC2的比例為(1.22±0.08)％，與對(duì)照相(0.50±0.16)％比，有了明顯的上升(P<0.05)；3AO上清作用后DC1的比例為(59.68±12.02)％，與對(duì)照相(74.33±14.07)％比，有了明顯的下降(P<0.0

8、5)；DC2的比例為(2.73±1.07)％，與對(duì)照相(1.25±0.58)％比，有了明顯的上升(P<0.05)。 3.SKOV3上清作用后DC的成熟標(biāo)記CD80(84.06±10.59)％與對(duì)照(74.28±15.92)％相比，有了顯著的上升(P<0.05)。成熟標(biāo)記CD86(92.46±10.25)％與對(duì)照(83.94±10.87)％相比，也同樣有了顯著的上升(P<0.05)；3AO上清作用后CD80(86.25±4.52)％與對(duì)照

9、(65.90±13.30)％相比，有了顯著的上升(P<0.05)。CD86(90.50±7.34)％與對(duì)照(80.68±8.83)％相比，也同樣有了顯著的上升(P<0.05)。 4.SKOV3上清作用后DC刺激CD3+T細(xì)胞增殖的能力按DC與T細(xì)胞比例不同分別是DC:T=1:10時(shí)，實(shí)驗(yàn)組SI值(4.58±0.11)，與對(duì)照組SI值(7.43±0.53)相比，顯著下降(P<0.05)；DC:T＝1:50時(shí)，實(shí)驗(yàn)組SI值(2.07

10、±0.06)，與對(duì)照組SI值(5.03±0.65)相比，顯著下降(P<0.05); DC：T=1:100時(shí)，實(shí)驗(yàn)組SI值(1.53±0.38)，與對(duì)照組SI值(4.08±0.94)相比，顯著下降(P<0.05)。 3AO上清作用后DC刺激CD3+T細(xì)胞增殖的能力按DC與T細(xì)胞比例不同分別是DC:T=1:10時(shí)，實(shí)驗(yàn)組SI值(5.07±0.71)，與對(duì)照組SI值(6.08±1.53)相比，有下降趨勢(shì)，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05

11、); DC:T=1:50時(shí)，實(shí)驗(yàn)組SI值(2.18±0.32)，與對(duì)照組SI值(4.04±0.70)相比，顯著下降(P<0.05)；DC:T=1:100時(shí)，實(shí)驗(yàn)組SI值(2.04±0.35)，與對(duì)照組SI值(2.05±0.71)相比，無(wú)顯著差別(P>0.05)。 結(jié)論： 1.該實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用rhGM-CSF+rhIL-4并與TNF-α聯(lián)合培養(yǎng)誘導(dǎo)人外周血CD14單核細(xì)胞誘導(dǎo)獲得成熟DC的方法，建立了一個(gè)穩(wěn)定的體外誘導(dǎo)DC的