低劑量阿維菌素對(duì)家蠶的遺傳毒性研究.pdf

1、家蠶是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期馴化的鱗翅目經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，對(duì)農(nóng)藥十分敏感，抗藥性遠(yuǎn)小于野外生存的害蟲(chóng)。在蠶區(qū)農(nóng)林害蟲(chóng)的化學(xué)防治過(guò)程中，農(nóng)藥可直接或間接地通過(guò)觸殺、胃毒、熏蒸等多種途徑造成家蠶中毒。阿維菌素(avermectin)是由灰色鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)發(fā)酵產(chǎn)生的一類(lèi)十六元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化合物，其殺蟲(chóng)機(jī)制是通過(guò)作用昆蟲(chóng)神經(jīng)元突觸或神經(jīng)肌肉突觸的γ-氨基丁酸(GABA)受體，刺激GABA釋放，從而干擾正常的神經(jīng)活動(dòng)，造成昆蟲(chóng)

2、麻痹、拒食并最終死亡。由于阿維菌素具有高效、廣譜的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的防治。家蠶對(duì)阿維菌素敏感性極強(qiáng)，蠶區(qū)時(shí)有該農(nóng)藥中毒引起蠶繭產(chǎn)量下降的事件發(fā)生。
　　 本學(xué)位論文主要研究了低劑量阿維菌素對(duì)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)利用的影響;對(duì)幼蟲(chóng)血細(xì)胞DNA的損傷;對(duì)血細(xì)胞基因表達(dá)的影響;對(duì)血液蛋白表達(dá)的影響，較全面地評(píng)價(jià)了低劑量阿維菌素對(duì)家蠶的遺傳毒性。
　　 1.基于阿維菌素對(duì)家蠶96 h急性毒性的試

3、驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置了1、2、4、8μg/L四個(gè)添毒劑量，評(píng)價(jià)了低劑量阿維菌素對(duì)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)利用、吐絲結(jié)繭等生理過(guò)程的影響。結(jié)果表明:1μg/L阿維菌素對(duì)家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育、食物利用基本沒(méi)有影響，2、4、8μg/L阿維菌素會(huì)造成幼蟲(chóng)體重、相對(duì)生長(zhǎng)率、相對(duì)取食量、食物利用率、食物轉(zhuǎn)化率、單繭重等指標(biāo)下降，且下降程度與阿維菌素添毒劑量呈正相關(guān)。
　　 2.采用SCGE方法分析了1、2、4μg/L阿維菌素對(duì)家蠶4齡幼蟲(chóng)血細(xì)胞DNA的影響，通

4、過(guò)觀(guān)察添毒后第1、3、5、7、9天DNA的彗星表現(xiàn)來(lái)評(píng)價(jià)阿維菌素對(duì)家蠶血細(xì)胞DNA的損傷效應(yīng)和遺傳毒性。彗星尾部DNA％和尾距的數(shù)據(jù)分析表明:與對(duì)照組相比，1、2、4μg/L阿維菌素對(duì)家蠶血細(xì)胞DNA均有明顯的損傷作用，且損傷程度與添毒劑量呈正相關(guān);在整個(gè)添毒過(guò)程中，尾部DNA％和尾距在處理后第3天達(dá)到最大值，然后開(kāi)始下降，第9天達(dá)到本次實(shí)驗(yàn)的最小值，整體表現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明了低劑量阿維菌素對(duì)家蠶血細(xì)胞DNA具有遺

5、傳毒性，能夠造成血細(xì)胞的損傷，且損傷程度與添毒劑量和添毒時(shí)間相關(guān)。
　　 3.采用RAPD方法分析了1、2、4、8μg/L阿維菌素對(duì)家蠶4齡幼蟲(chóng)血細(xì)胞DNA的變異。添毒96 h后基因組DNA分析結(jié)果為:24條RAPD引物擴(kuò)增產(chǎn)生的清晰條帶總數(shù)為143條，其中多態(tài)性條帶19條，多態(tài)性帶數(shù)比率為13.29％。用Ntsyspc2.1軟件計(jì)算出不同阿維菌素處理組樣品血細(xì)胞DNA間的遺傳相似系數(shù)分布在0.867～0.993，樹(shù)狀聚類(lèi)圖顯示

6、對(duì)照組樣品與1、2、4μg/L3個(gè)處理聚為一類(lèi)，8μg/L處理單獨(dú)聚為一類(lèi)，說(shuō)明8μg/L阿維菌素造成家蠶血細(xì)胞DNA的變異最大，即對(duì)血細(xì)胞DNA的損傷最嚴(yán)重。
　　 4.采用ACP-based PCR方法分析了家蠶4齡幼蟲(chóng)血細(xì)胞在1μg/L阿維菌素壓力下的差異表達(dá)基因，篩選到15個(gè)表達(dá)差異在2倍或以上的基因。其中Ribosomal protein S18(DEG4)、ALY(DEG5)、Ribosomal protein S8

7、(DEG7)、Ribosomal protein L6(DEG8)、Ribosomal protein L23A(DEG9)、ERp57(DEG10)、QM(DEG11)、Ribosomal protein L35(DEG13)、Rad23(DEG14)、Ribosomal protein L11(DEG15)是上調(diào)表達(dá)基因;Polyubiquitin(DEG1)、ANT(DEG2)、Glycoprotein(DEG3)、Ribosom

8、al protein L7(DEG6)、Y-box(DEG12)是下調(diào)表達(dá)基因。推測(cè)其中一部分基因的差異表達(dá)與家蠶血細(xì)胞的DNA損傷或者損傷修復(fù)相關(guān)，還有一部分基因的差異表達(dá)是家蠶在阿維菌素壓力下的一種應(yīng)答表現(xiàn)。
　　 5.采用2-DE和MALDI-TOF/TOF方法分析了家蠶4齡幼蟲(chóng)血液在1μg/L阿維菌素處理前后的蛋白表達(dá)特征。通過(guò)比對(duì)電泳圖譜發(fā)現(xiàn)5個(gè)差異蛋白，其中3個(gè)在處理組中下調(diào)表達(dá)，1個(gè)在處理組中上調(diào)表達(dá)，還有1個(gè)在對(duì)

9、照組中特異性表達(dá)。蛋白鑒定結(jié)果顯示:2號(hào)差異蛋白是一種血液蛋白(Hemolymph protein)，分子量為29.7 kD，屬于家蠶30 K蛋白家族成員，其功能是為幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育提供能量;3號(hào)差異蛋白是一種神經(jīng)系統(tǒng)特異蛋白前體(Bombyrin precursor)，分子量為22.5 kD，它可能與維持幼蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性有關(guān)。4號(hào)差異蛋白是一種促進(jìn)蛋白(Promoting protein，PP)，分子量為17.2 kD，推測(cè)可能與家蠶