人源Fab噬菌體抗體庫的構(gòu)建及抗IL-4抗體的初步篩選.pdf

1、背景和目的：白細(xì)胞介素-4(interleukin-4.IL-4)是20世紀(jì)80年代初發(fā)現(xiàn)的，是具有多種生物學(xué)功能的一種細(xì)胞因子。主要出活化的TH2細(xì)胞及肥大細(xì)胞等產(chǎn)生[1]。IL-4在炎癥的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，IL-4作為TH2細(xì)胞的特征細(xì)胞因子，在以Th2為特征的炎癥反應(yīng)中促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展，其促炎的途徑有多種。IL-4雖然在炎癥發(fā)生發(fā)展中有重要作用，但其廣泛的生物學(xué)功能使其在許多疾病治療中也起到作用，特別在腫瘤，白血病、自身免疫

2、性疾病治療中都有較好的效果。研究表明IL-4不僅可以治療許多疾病，同樣IL-4也可以導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，在一些疾病的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用，如哮喘，過敏性疾病，腎小球疾病，卵巢癌等腫瘤，腦梗塞等疾病[2-5]。IL-4在上述疾病中都有不同的變化，這種變化對(duì)這些疾病有很大的影響。因此檢測(cè)其在人體內(nèi)的變化是研究IL-4與疾病關(guān)系的重要手段。目前許多基因工程抗體已經(jīng)用于臨床研究，如Rutgers等[6]從噬菌體抗體庫中篩選得到β淀粉樣蛋白抗體

3、。同樣如果通過基因工程制備出IL-4抗體，對(duì)臨床疾病的診治也會(huì)有好處?，F(xiàn)存的檢測(cè)IL-4的主要方法是酶免疫檢測(cè)法。這種方法是用動(dòng)物源性單克隆抗體包被ELSIA板來檢測(cè)IL-4。但通過雜交瘤技術(shù)得到的抗體，無法避免抗體異源性的問題，給檢測(cè)帶來了誤差。而且傳統(tǒng)方法制備的抗體存在量少，工作繁瑣，周期較長(zhǎng)等問題，給研究IL-4帶來了困難。因此快速，有效制備出人源化的抗體成為了亟待解決的問題。
　　 噬菌體抗體展示庫技術(shù)的出現(xiàn)為人源抗體的

4、制備提供了新的思路，使快速獲得人源抗體片段成為可能，噬菌體抗體庫技術(shù)源于基因工程技術(shù)，它是將人抗體基因片段組裝到載體內(nèi)，然后展示到噬菌體表面得到多樣性噬菌體抗體的集合即為人源噬菌體抗體庫最初由Clackson[7]等闡述，從抗體庫中就可快速篩選到人源化的抗體，抗體庫技術(shù)是一種篩選高質(zhì)量人源性抗體的穩(wěn)定而簡(jiǎn)便的技術(shù)。這種技術(shù)不經(jīng)免疫，繞過雜交瘤技術(shù)，直接利用抗原從抗體庫中篩選特異性抗體，較好地解決了人雜交瘤技術(shù)低效及人體排異反應(yīng)的難題。本

5、研究采用噬菌體表面展示技術(shù)在本室構(gòu)建的抗體庫的基礎(chǔ)上進(jìn)行了變化，重新構(gòu)建了一個(gè)庫容量大、多樣性好的人源Fab噬菌體抗體庫，搭建了人源抗體制備技術(shù)平臺(tái)，用于制備IL-4抗體，為下一步進(jìn)行抗體的表達(dá)、純化、大量制備以及進(jìn)一步的臨床應(yīng)用研究提供必要的前提。
　　 方法：從正常健康成人的外周血中分離淋巴細(xì)胞，提取總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法擴(kuò)增人抗體重鏈Fd段和輕鏈基因。輕鏈擴(kuò)增產(chǎn)物和噬菌粒載體pComb3XSS分別經(jīng)Sa

6、cⅠ/XbaⅠ雙酶切，由T4 DNA連接酶連接，電穿孔轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue，擴(kuò)增后提取噬菌粒，構(gòu)建輕鏈庫。輕鏈庫質(zhì)粒經(jīng)SacⅠ/XbaⅠ酶切鑒定。輕鏈庫噬菌粒DNA和重鏈Fd段擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ/SpeⅠ雙酶切，以同樣方法連接后轉(zhuǎn)化XL1-Blue，加入輔助噬菌體VCSM13，構(gòu)建Fab噬菌體抗體庫。隨機(jī)挑取若干單克隆酶切鑒定基因片段的插入；并以提取的噬菌體抗體庫噬粒DNA為模板，以輕、重鏈不同引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以I

7、L-4為抗原對(duì)構(gòu)建的抗體庫進(jìn)行5輪篩選。Phage-ELISA鑒定IL-4特異性噬菌體抗體，并選取陽性克隆測(cè)定輕鏈、重鏈(Fd)DNA序列，進(jìn)行同源性分析。
　　 結(jié)果：構(gòu)建的人源Fab噬菌體抗體庫庫容為2.4×108，酶切和PCR鑒定插入基因片段大小正確，以IL-4為抗原對(duì)抗體庫進(jìn)行5輪篩選得到了340倍的富集，Phage-ELISA鑒定陽性克隆有抗原結(jié)合活性。陽性克隆結(jié)果顯示，陽性克隆重鏈核苷酸序列與人免疫球蛋白γ鏈同源性為