不同飽和度脂肪酸對(duì)豬骨骼肌細(xì)胞脂質(zhì)代謝影響的研究.pdf

1、豬肉風(fēng)味是豬肉品質(zhì)的重要組成部分，日糧脂肪酸組成可以通過(guò)影響豬骨骼肌細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸組成以及肌肉內(nèi)脂肪含量，影響豬肉風(fēng)味。本文通過(guò)研究不同飽和度脂肪酸對(duì)骨骼肌細(xì)胞脂質(zhì)沉積和代謝的影響，旨在為日糧脂肪酸改善豬肉品質(zhì)提供理論依據(jù)。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)不同碳鏈長(zhǎng)度、飽和程度的脂肪酸有著不同的氧化速率。而且不同飽和程度的脂肪酸在不同組織和細(xì)胞中的代謝也存在差異。體外分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)成肌分化的豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞可作為研究豬骨骼肌代謝的體外模型。本研究

2、利用杜長(zhǎng)大三元雜交豬背最長(zhǎng)肌分離細(xì)胞，構(gòu)建豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，研究不同飽和度脂肪酸棕櫚酸(Palmitic acid,PA)、油酸(Oleic acid，OA)、亞油酸(Llinoleic acid，LA)在豬骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的沉積和代謝差異，并對(duì)這些差異產(chǎn)生的原因進(jìn)行了探討。本研究發(fā)現(xiàn)不同飽和度脂肪酸在豬骨骼肌細(xì)胞沉積不同，繼而利用同位素示蹤法跟蹤脂肪酸在豬骨骼肌細(xì)胞中的代謝過(guò)程，并通過(guò)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡的方法檢測(cè)該細(xì)

3、胞脂肪酸代謝途徑中關(guān)鍵分子的基因和蛋白表達(dá)，初步揭示不同脂肪酸對(duì)豬骨骼肌細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響。通過(guò)對(duì)豬骨骼肌細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因蛋白分析及后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)多不飽和脂肪酸可能是通AMPK途徑而非PPARγ影響豬骨骼肌細(xì)胞脂肪酸攝取和氧化。本研究建立了豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，探究了不同飽和度脂肪酸代謝差異及其機(jī)制，旨在為不同飽和度脂肪酸影響豬骨骼肌細(xì)胞脂質(zhì)代謝提供理論基礎(chǔ)，為豬肉品質(zhì)改善和人類相關(guān)疾病提供借鑒。研究所取得的成果如下:<

4、br>　　1.豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外模型的建立
　　選擇新生3日齡杜長(zhǎng)大仔豬，取背最長(zhǎng)肌分離得到豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，顯微鏡觀察細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形。細(xì)胞長(zhǎng)到80～90％融合時(shí)，采用2％馬血清誘導(dǎo)細(xì)胞成肌分化，誘導(dǎo)3天后顯微鏡下細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)狀平行排列，有融合趨勢(shì)，誘導(dǎo)5天后大量細(xì)胞融合，初步判斷為豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。通過(guò)q-PCR檢測(cè)成肌分化過(guò)程中基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn):分化初期生肌決定因子（Myogenic Differentiation Antige

5、n，MyoD)有較高表達(dá)量，分化標(biāo)志因子肌細(xì)胞生成素(Myogenin，MyoG)在分化初期表達(dá)量急劇提高。提示:豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在成肌誘導(dǎo)1天后即開始分化，分化5天后開始大量融合，滿足研究所需豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞和豬骨骼肌細(xì)胞體外模型的需要，可進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
　　2.不同飽和度脂肪酸在豬骨骼肌細(xì)胞的代謝差異
　　100μM PA、OA、LA孵育豬骨骼肌細(xì)胞后，油紅O和甘油三酯測(cè)定發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯沉積顯著增加(P＜0.05)，且

6、多不飽和脂肪酸亞油酸處理組顯著高于棕櫚酸和油酸處理組(P＜0.05)。本試驗(yàn)利用同位素示蹤法對(duì)脂肪酸處理后豬骨骼肌細(xì)胞脂質(zhì)代謝每個(gè)過(guò)程進(jìn)行相對(duì)定量，試驗(yàn)用[1-14C]100μM脂肪酸處理細(xì)胞24h后利用放射性衰變率分別對(duì)細(xì)胞脂肪酸攝取、脂肪酸氧化、細(xì)胞總脂質(zhì)和細(xì)胞脂質(zhì)分類進(jìn)行相對(duì)定量，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單不飽和脂肪酸OA和多不飽和脂肪酸LA處理組的脂肪酸攝取量顯著高于飽和脂肪酸PA組（P＜0.05），LA組脂肪酸氧化量均最高(P＜0.05)，雖

7、三個(gè)脂肪酸組處理后細(xì)胞總脂質(zhì)含量無(wú)顯著差異，但LA在甘油三酯中的沉積量最高，PA進(jìn)入磷脂最多。以上結(jié)果提示:細(xì)胞外脂肪酸孵育可以影響豬骨骼肌細(xì)胞脂肪酸代謝，與飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸相比，多不飽和脂肪酸亞油酸可以顯著促進(jìn)脂肪酸攝取、氧化和甘油三酯沉積。
　　3.不同飽和度脂肪酸對(duì)豬骨骼肌細(xì)胞脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因蛋白的影響
　　骨骼肌細(xì)胞內(nèi)脂肪酸不僅是細(xì)胞脂質(zhì)代謝的原料和產(chǎn)物，還可作為某些轉(zhuǎn)錄因子或酶的配體與之結(jié)合從而影響包括脂

8、質(zhì)代謝在內(nèi)的諸多細(xì)胞代謝過(guò)程。骨骼肌細(xì)胞的脂質(zhì)代謝過(guò)程是由脂肪代謝過(guò)程的酶和因子決定的，通過(guò)了解這些關(guān)鍵過(guò)程中酶和因子基因表達(dá)的改變，初步探討不同飽和度脂肪酸引起豬骨骼肌細(xì)胞脂質(zhì)代謝差異產(chǎn)生的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)與棕櫚酸和油酸處理組相比，亞油酸能夠顯著提高骨骼肌細(xì)胞脂肪酸攝取相關(guān)基因CD36、FABP4、FATP1，脂肪酸氧化相關(guān)基因CPT1、COX、CytC的基因表達(dá)(P＜0.05)，以及線粒體功能相關(guān)蛋白NRF1的表達(dá)，并能夠顯著促進(jìn)甘油

9、三酯合成相關(guān)基因DGAT2、FAS的表達(dá)(P＜0.05)。
　　4.不同飽和度脂肪酸引起豬骨骼肌細(xì)胞脂質(zhì)代謝差異的通路
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)棕櫚酸、油酸、亞油酸能夠通過(guò)影響PPARγ磷酸化從而引起豬脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積差異。相比于長(zhǎng)白豬，金華豬骨骼肌細(xì)胞內(nèi)有更多脂質(zhì)沉積，研究發(fā)現(xiàn)其PPARγ磷酸化程度低于長(zhǎng)白豬，說(shuō)明PPARγ磷酸化可能在骨骼肌脂質(zhì)代謝過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)不同脂肪酸處理后，PPARγ磷酸化水平無(wú)顯著

10、差異。ERK是PPARγ112位磷酸化激酶，ERK抑制劑和脂肪酸共同處理細(xì)胞后，骨骼肌細(xì)胞的脂質(zhì)沉積并無(wú)顯著變化。研究證明與脂肪細(xì)胞不同，不同飽和程度的脂肪酸并非通過(guò)PPARγ112位磷酸化途徑影響豬骨骼肌脂質(zhì)代謝。誘導(dǎo)成肌分化過(guò)程中，AMPKα2基因的表達(dá)量隨著骨骼肌成肌分化逐漸升高(P＜0.05)，提示其可能在成熟骨骼肌細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。不同脂肪酸處理后發(fā)現(xiàn)LA處理組AMPK基因及pAMPK表達(dá)量提高(P＜0.05)。添加AMPK