腺病毒介導(dǎo)的雙基因(anti-VEGF發(fā)夾狀核酶+IL-24)治療結(jié)腸癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景及目的：結(jié)腸癌的發(fā)病率不斷上升，但結(jié)腸癌的治療效果仍不理想，特別是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的患者。VEGF在腫瘤血管形成方面起著關(guān)鍵作用，VEGF在大多數(shù)結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，并且其表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者的復(fù)發(fā)和預(yù)后高度相關(guān)。發(fā)夾狀核酶(hairpin ribozyme)是一種有催化活性的RNA，它能特異切割、降解含有能被其識別序列的靶mRNA，從而抑制該基因的表達(dá)。白細(xì)胞介素-24即黑素瘤分化相關(guān)基因-7(IL-24/Mda-7)，是細(xì)胞因子白細(xì)胞

2、介素-10基因家族成員。高表達(dá)白細(xì)胞介素-24在許多腫瘤中能引起腫瘤細(xì)胞凋亡和腫瘤生長抑制，但其對正常上皮細(xì)胞未產(chǎn)生明顯的有害影響。本研究旨在構(gòu)建帶有雙基因(抗VEGF-發(fā)夾狀核酶+白細(xì)胞介素-24)的復(fù)制缺陷型腺病毒載體，并在細(xì)胞水平及移植瘤水平觀察帶有抗。VEGF-發(fā)夾狀核酶和白細(xì)胞介素-24的腺病毒對結(jié)腸癌VEGF表達(dá)的抑制作用以及對結(jié)腸癌生長的抑制作用。 方法：根據(jù)Genebank公布的VEGF165基因序列設(shè)計并合成編

3、碼抗VEGF165的發(fā)夾狀核酶的雙鏈DNA，所合成的雙鏈DNA兩端分別帶有Sal I、Bgl II酶切位點(diǎn)。將該雙鏈DNA插入包含IRES(克隆于Sal I和Not I之間)和人IL-24基因(克隆于Xho I和Xba I之間)的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAdTrack-CMV-IRES-IL-24的相應(yīng)多克隆位點(diǎn)上(pAdTrack-CMV-IRES-IL-24蘇州大學(xué)細(xì)胞與分子生物學(xué)教研室構(gòu)建并測序保存)。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAdTrack-CMV-Rz/I

4、L-24經(jīng)PmeI酶切后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在BJ5183大腸桿菌中同源重組，得到的重組質(zhì)粒pAdTrack-CMV-Rz/IL-24-AdEasy-1經(jīng)PacI酶切后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞，在293細(xì)胞中包裝成完整病毒(命名為Ad-Rz/IL24)并復(fù)制擴(kuò)增，獲得重組腺病毒Ad-Rz/IL24。同時構(gòu)建僅帶有抗。VEGF發(fā)夾狀核酶的腺病毒(Ad-Rz)作為對照，帶有IL-24的腺病毒(Ad-IL24)和空病毒載

5、體(Ad-GFP)由蘇州大學(xué)細(xì)胞與分子生物學(xué)教研室構(gòu)建。RT-PCR及免疫熒光法檢測病毒感染后抗-VEGF發(fā)夾狀核酶及白細(xì)胞介素-24在HT-29細(xì)胞中的表達(dá)，Real-time PCR及ELISA檢測其對VEGF mRNA及蛋白表達(dá)的抑制作用，MTT法和流式細(xì)胞儀檢測Ad-Rz/IL24對HT-29細(xì)胞生長抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。在Balb/c裸鼠皮下建立HT-29細(xì)胞動物移植瘤模型，觀察Ad-Rz/IL24基因治療對結(jié)腸癌移植瘤生長的抑

6、制作用，免疫組化法檢測白細(xì)胞介素-24、生長抑制和DNA損傷基因(GADD)及VEGF在移植瘤組織中的表達(dá)，CD34標(biāo)記檢測移植瘤組織微血管密度(MVD)。 結(jié)果：成功將抗-VEGF發(fā)夾狀核酶和白細(xì)胞介素-24克隆至同一復(fù)制缺陷型腺病毒載體上。實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建復(fù)制缺陷型腺病毒Ad-Rz/IL24可以有效感染結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞，Ad-Rz/IL24感染HT-29細(xì)胞后抗-VEGF發(fā)夾狀核酶和白細(xì)胞介素-24可在HT-29細(xì)胞中高效表達(dá)

7、。Ad-Rz/IL24能顯著抑制HT-29細(xì)胞VEGF的表達(dá)，Ad-Rz/IL24、Ad-Rz、Ad-IL24感染48小時后HT-29細(xì)胞中VEGFmRNA的相對表達(dá)量分別為PBS組的(39.0±1.0)％，(45.0±1.0)％和(91.0±1.0)％，與PBS比較P<0.05；Ad-GFP組(空病毒載體)中VEGF的相對表達(dá)量為PBS組的(122.0±2.0)％；在蛋白水平，Ad-Rz/IL24、Ad-Rz、Ad-IL24、Ad-G

8、FP及PBS組細(xì)胞上清液中VEGF蛋白含量(OD.值)分別為0.37±0.28/million cells，0.46±0.35/million cells，0.56±0.30/million cells，0.74±0.13/ million cells和0.81±0.16/million cells。MTT示Ad-Rz/IL24、Ad-IL-24可顯著抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的生長，Ad-Rz對人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的生長有

9、一定的抑制作用，其差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。Ad-Rz/IL24誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞凋亡率為(11.00±0.80)％，大約為Ad-IL-24所誘導(dǎo)凋亡的兩倍(ad-IL-24凋亡率：(5.60±0.27)％。Ad-Rz所誘導(dǎo)得HT-29細(xì)胞凋亡率約(1.83±0.18)％，與PBS組和Ad-GFP組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Ad-Rz/IL24可在一定程度上抑制HT-29細(xì)胞移植瘤的生長，與PBS比較統(tǒng)計學(xué)意義處于臨界狀態(tài)間(P=0.0619，

10、秩和檢驗(yàn))，而Ad-Rz、Ad-IL24對移植瘤生長的抑制作用無統(tǒng)計學(xué)意義。使用免疫組化方法在Ad-Rz/IL24及Ad-IL-24處理組移植瘤中均檢測到了白細(xì)胞介素-24及GADD的表達(dá)，Ad-Rz/IL-24可以顯著抑制移植瘤組織中VEGF的表達(dá)及微血管密度(MVD)，各組MVD分別為：PBS12.8±11.1，Ad-GFP11.5±1.0，Ad-IL-246.0±1.0，Ad-Rz4.3±0.5，Ad-Rz/IL243.5±0.6