凋亡抑制基因XIAP在食管癌中的表達及RNAi下調(diào)其在食管癌中表達對化療敏感性影響的研究.pdf

1、目的： 食管癌是人類常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率較高，在地區(qū)間差別較大。它的特征是早期診斷比較困難且預后差，我國食管癌的發(fā)病率目前居世界第一位，發(fā)病人數(shù)占發(fā)病總數(shù)的60％，且男性的發(fā)病率是女性的2倍。全世界每年新發(fā)食管癌病例約30萬。我國食管癌發(fā)病率為13/10萬，但是食管癌的確切發(fā)病機制尚不明確，且對于食管癌的治療主要是手術治療為主聯(lián)合放療和化療的綜合治療，但是現(xiàn)有方法已經(jīng)達到其治療的極限，只有深入研究其發(fā)病機制，并尋找新的治療

2、方式才能提高食管癌的治愈率?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生與其凋亡率降低有關，最重要的凋亡通路就是Caspase通路。X染色體連鎖的凋亡抑制基因(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)是凋亡抑制基因家族中重要的成員之一，其編碼的蛋白XIAP通過選擇性的抑制Caspase-3，-7和-9，并參與其它途徑來抑制細胞的凋亡，XIAP是該基因家族中唯一能夠同時抑制起始和效應階段的IAP。本研究擬在

3、探索XIAP與食管癌之間的關系，從三個方面探討XIAP與食管癌的發(fā)生發(fā)展以及對食管癌化療敏感性的影響。 第一，通過免疫組化、RT-PCR和Westem Blot檢測XIAP在食管鱗癌和正常食管組織中的表達，并檢測其在多株食管鱗癌細胞系中的表達情況； 第二，通過化學合成法合成的XIAP特異的siRNA，觀察能否通過RNAi方法降低XIAP在食管癌細胞中的表達： 第三，若能通過RNAi方法降低食管癌細胞中XIAP的表

4、達，探討XIAP低表達對食管癌細胞凋亡的影響，更重要的是觀察其對多種化療藥物敏感性影響。 材料與方法： 1、臨床標本及組織芯片制作：食管鱗癌及癌旁正常食管配對組織取自安徽醫(yī)科大學胸外科，由2位以上資深病理學家診斷為食管鱗癌，所有病人術前均未經(jīng)放化療。新鮮組織采用手術分離，并在術后立即置于液氮中凍存，選取110對食管癌配對組織常規(guī)石蠟包埋。 組織芯片在Beecher組織芯片儀制作完成，在蠟塊上設計14×7共98點組

5、織陣列，打孔并將供體蠟塊標記部位取出的組織柱推入預先設計的相應孔內(nèi)；對蠟塊進行連續(xù)切片，裱于防脫片載玻片上。 2、食管鱗癌細胞培養(yǎng)：本研究中選用的人食管鱗癌細胞系，其中TE10、KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE410、KYSE450、KYSE510細胞系由日本Kyoto University的ShimadaY博士惠贈，EC9706由王明榮教授惠贈。食管癌細胞被培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)基中，這個培養(yǎng)基含有10

6、％胎牛血清，不含有抗生素，生長環(huán)境是5％CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 3、siRNA合成及細胞轉染：XIAP-siRNA由Invitrogen公司設計合成，并在Hela細胞中驗證其對XIAP的抑制效率。我們采用脂質(zhì)體法，應用Lipofectamine2000轉染試劑進行轉染，siRNA轉染濃度為25nm。 4、RT-PCR半定量法檢測XIAP在組織標本和細胞中的表達：食管癌組織、癌旁正常食管組織和食管癌細胞均按Tr

7、izol法提取總RNA，然后進行RT-PCR，最終的結果應用Gel-pro Analyzer軟件進行半定量分析。 5、Western Blot半定量法檢測XIAP在組織標本和細胞中的表達：食管癌組織、癌旁正常食管組織和食管癌細胞按照常規(guī)方法提取胞漿總蛋白，進行蛋白定量后，進行Western Blot，最終的結果應用Gel-pro Analyzer軟件進行半定量分析。 6、免疫組織化學染色及結果分析：采用微波法修復抗原，應

8、用ABC免疫組化試劑盒按照ABC法進行免疫組化染色，免疫組化染色結果采用二級記分法進行判定，結果判定由兩位病理科醫(yī)生分別獨立完成，取二者平均值作為最終結果。 7、流式細胞術檢測細胞凋亡：同時收集懸浮和貼壁生長的細胞，PI法染色，應用FACSCalibur flow cytometer流式細胞儀檢測，CellQuest軟件進行結果分析，sub-G1-G0區(qū)細胞被認定為凋亡細胞。 8、化療藥物處理及MTT法檢測細胞活性：按照

9、實驗設計對接種于96孔板的細胞進行siRNA轉染，并加入相應濃度的化療藥物，在設定的時間點應用MTT法檢測細胞活性。 9、應用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計分析，XIAP在食管癌和正常組織表達的差異應用非配對T檢驗進行，XIAP的表達與臨床病理因素之間的關系用卡方檢驗和Sperman’s相關分析進行分析。IC50的計算采用Probit分析法計算，不同組之間的均數(shù)比較采用Student-Neuman-Keuls多樣本均數(shù)檢驗進行分析

10、。P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。 結果： 1、首先我們通過免疫組織化學、RT-PCR和Wesern Blot的方法檢測XIAP mRNA和XIAP蛋白在食管鱗癌組織、癌旁正常食管組織和食管鱗癌細胞系中的表達，不同的方法檢測的結果一致顯示其在食管癌組織中的表達顯著高于其在正常食管組織中的表達(統(tǒng)計分析均顯示P<0.01)，同樣其在大多數(shù)食管癌細胞系中高表達，但是其在食管癌組織中的表達與食管癌患者的臨床病理因素如：患者的年齡

11、、性別、食管癌的分化程度和TNM分期無統(tǒng)計學相關。 2、選擇了兩株XIAP高表達細胞系KYSE150、EC9706和兩株XIAP低表達細胞系TE10、KYSE510，進行XIAP-siRNA轉染，選取轉染后24小時、48小時和72小時三個時間點，通過RT-PCR和Westem Blot檢測發(fā)現(xiàn)，XIAP-siRNA在mRNA和蛋白水平均能夠有效地降低XIAP的表達，對XIAP的抑制率可以達到90％以上。 3、應用XIA

12、P-siRNA進行RNA干擾后食管癌細胞XIAP低表達，我們檢測了其對細胞凋亡的影響，結果顯示在XIAP高表達細胞系，XIAP的表達降低能夠顯著增加細胞的凋亡，而在XIAP低表達細胞系中XIAP的低表達對細胞的凋亡率沒有影響(P<0.01)，這兩方面結果提示食管癌細胞凋亡的增加確實是由XIAP的表達降低引起的。 4、在研究XAIP低表達后對食管癌細胞化療敏感性的影響中，結果發(fā)現(xiàn)，在XIAP高表達細胞系KYSE150、EC9706

13、中，降低XIAP的表達能夠顯著增加所有細胞對所有化療藥物紫杉醇(PTX)、順鉑(DDP)、依托泊苷(VP-16)和氟尿嘧啶(5-Fu)的敏感性；而對于XIAP低表達系，在TE10僅能增加對四種中的三種化療藥物紫杉醇(PTX)、順鉑(DDP)和依托泊苷(VP-16)的敏感性，在KYSE150中僅能增強對紫杉醇(PTX)敏感性，且這兩株細胞中，XIAP低表達對化療藥物敏感性的增加遠不如在XIAP高表達細胞系中顯著。 結論：

14、1、X染色體連鎖的凋亡抑制基因XIAP在食管鱗癌組織中明顯高于其在正常食管組織中的表達，但是與患者的臨床病理因素(年齡、性別、食管癌的分化程度和TNM分期)無關，基于此，可為食管鱗癌的病理診斷提供了一個新的免疫組織化學指標，可能會對食管癌的診斷提供一定的輔助作用。 2、XIAP特異的siRNA能夠顯著降低食管癌細胞中XIAP的表達，在降低XIAP后，能夠顯著增加XIAP高表達食管癌細胞的細胞凋亡，進一步驗證了XIAP主要通過Cs