羽苔素E與唑類藥物對耐藥白念珠菌的聯(lián)合作用及機制研究.pdf

1、近二十年來，深部真菌感染的發(fā)病率正在逐年上升。盡管致病性真菌種類繁多，但白念珠菌仍然是院內(nèi)真菌感染最常見的致病性真菌，其系統(tǒng)性感染死亡率高，是引起癌癥患者和艾滋病患者死亡的主要原因。在抗真菌藥物中，氟康唑應(yīng)用最為廣泛，但是由于長期大量使用，已產(chǎn)生了越來越多的氟康唑耐藥白念珠菌。而且，對氟康唑耐藥的臨床分離白念珠菌株通常對其他唑類藥物也能夠產(chǎn)生交叉耐藥。針對上述問題，藥物聯(lián)合應(yīng)用治療真菌感染的研究正在大量展開，以期為真菌感染尋找可行的解決

2、方法。藥物聯(lián)用具備多種優(yōu)勢，如擴大抗菌譜，提高抗菌效能，提高安全性與耐受性，不易誘發(fā)耐藥等。已報道的聯(lián)合用藥多局限在少數(shù)抗真菌藥物之間的合用，有些抗真菌藥物合用后反而會產(chǎn)生拮抗作用，并且針對氟康唑耐藥的臨床白念珠菌的聯(lián)合治療報道較少。 羽苔素E是從苔蘚類植物地錢中提取的雙聯(lián)芐類化合物，初步的抗菌活性篩選表明具有潛在的抗真菌活性，前期的實驗結(jié)果證實對于氟康唑耐藥株，羽苔素E與氟康唑合用能明顯降低兩藥的用藥量，增加氟康唑在耐藥株細胞

3、內(nèi)的聚集，對耐藥株表現(xiàn)出協(xié)同的抗真菌作用。并且在高劑量(128μg/ml)下，羽苔素E可明顯抑制白念耐藥株主動外排基因CDR1的表達水平。本課題研究羽苔素E與氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和伏立康唑合用對臨床分離氟康唑耐藥白念珠菌的抗真菌作用，并對其逆轉(zhuǎn)機制作進一步探討。 首先，采用NCCLS M-27A方案測定羽苔素E及氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和伏立康唑的體外敏感性，結(jié)果顯示3株臨床分離氟康唑耐藥白念珠菌對其他三個唑類藥物均顯示出抗

4、藥性，羽苔素E對實驗菌株的抗真菌活性與氟康唑相比較強。通過體外實驗棋盤式微量稀釋法檢測了羽苔素E與氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、伏立康唑合用對上述3株白念珠菌的MIC值，計算其相應(yīng)的FICI指數(shù)，結(jié)果表明合用對3株菌均表現(xiàn)出協(xié)同作用(FIC≤0.5)。對于臨床耐藥白念珠菌CA10，時間-殺菌曲線實驗中發(fā)現(xiàn)，羽苔素E與四種不同唑類聯(lián)合后，活菌濃度常用對數(shù)值比唑類單用組均降低了≥21gCFU/ml，進一步證實了兩藥的協(xié)同作用。并且體外實驗實驗結(jié)

5、果顯示兩藥合用對菌株生長曲線的抑制作用具有羽苔素E劑量依賴性，當氟康唑濃度為8μg/ml時，與三個不同濃度組羽苔素E合用后，其三個組的抑制作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 在此基礎(chǔ)上，觀察了羽苔素E對白念珠菌中若丹明6G泵出的影響。若丹明6G是白念珠菌細胞膜上能量依賴性ABC轉(zhuǎn)運蛋白的底物，對它的轉(zhuǎn)運能力可以判斷外排泵蛋白的底物轉(zhuǎn)運功能。羽苔素E對白念珠菌中若丹明6 G泵出實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8μg/ml的羽苔素E能夠顯著抑制若

6、丹明6G的泵出，并且隨著羽苔素E給藥濃度的提高，這種泵出抑制作用呈劑量依賴性增強。為了確定羽苔素E抑制若丹明6G泵出的機制是否是通過降低ABC轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)錄水平而起作用，我們應(yīng)用RT-PCR法檢測了若丹明泵出過程中(即與白念珠菌作用100min時)白念珠菌主動外排基因CDRl、CDR2的表達水平，未發(fā)現(xiàn)對這兩個基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用。同時，菌株與若丹明6G和氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、伏立康唑共同孵育時，四種唑類藥物均能引起若丹明6G的外排減少

7、，提示它們與若丹明6G存在共同的藥物結(jié)合位點。 既然羽苔素E抑制耐藥白念珠菌對若丹明6G的泵出不是依賴于外排基因的轉(zhuǎn)錄水平的提高，那么這種抑制作用的機制如何呢?我們進一步應(yīng)用定磷法測定了羽苔素E對耐藥白念珠菌CA10質(zhì)膜ATPase活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羽苔素E濃度為8μg/ml、16μg/ml和32μg/ml時均能夠抑制質(zhì)膜ATP酶活性，減少ATP水解，從而抑制外排蛋白的泵出功能；另外，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測羽苔素E

8、對白念珠菌耐藥株中ATP泵出的影響，由于ABC轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運底物時會泵出一定比例的ATP，而當羽苔素濃度為16μg/ml時，胞外的ATP濃度不僅未增高，反而明顯低于耐藥株空白組，結(jié)果間接提示羽苔素E可能不會被ABC轉(zhuǎn)運蛋白泵出胞外，并且抑制了外排泵功能。 在若丹明6G的泵出實驗中，觀察到羽苔素E與耐藥白念珠菌孵育100min對耐藥基因的mRNA.水平無明顯影響。我們進一步采用RT-PCR法考察了低濃度羽苔素E(16μg/ml)與耐

9、藥白念珠菌孵育不同的時間后主動外排基因CDRl和CDR2的表達水平。檢測時間點設(shè)置了2h、6h和18h，結(jié)果顯示作用時間為6h和18h時，羽苔素E均能夠顯著降低CDRl和CDR2的表達水平，而作用2h時，結(jié)果同前，對這兩個基因的表達都無明顯抑制作用。由此可知，羽苔素E對基因表達水平的影響可能是在2～6h間開始顯現(xiàn)。 綜上所述，本實驗研究發(fā)現(xiàn)羽苔素E與氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和伏立康唑合用后，具有較強的協(xié)同抗耐藥白念珠菌作用，作用