角質(zhì)形成細(xì)胞抗白念珠菌感染免疫作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究目的：探討角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte，KC)抗感染免疫作用的機(jī)制。角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮的主要結(jié)構(gòu)，約占表皮細(xì)胞的95％。過(guò)去常常認(rèn)為它們的功能僅僅是組成機(jī)體的外表屏障，在皮膚炎癥中，只能被動(dòng)地作為免疫細(xì)胞攻擊的靶細(xì)胞。近年來(lái)，隨著皮膚免疫系統(tǒng)(skinimmunesystem，SIS)概念的確立以及研究的進(jìn)展，充分證明角質(zhì)形成細(xì)胞具有免疫細(xì)胞的功能。主要依據(jù)是：表達(dá)免疫細(xì)胞的表面特征；輔助T細(xì)胞免疫應(yīng)答；在刺激因素存在的條

2、件下，能分泌細(xì)胞因子、趨化因子以及抗微生物多肽(簡(jiǎn)稱(chēng)抗菌肽)，廣泛參與皮膚的炎癥、免疫和病理過(guò)程。 念珠菌是一組常見(jiàn)的條件致病菌，廣泛存在于自然界和正常人的口腔、消化道、陰道以及皮膚上。在正常情況下，與機(jī)體處于共生狀態(tài)，皮膚、粘膜帶菌或受到污染，并不一定都發(fā)病，是否發(fā)病取決于念珠菌的毒力和宿主的免疫能力，特別是宿主的免疫功能在發(fā)病過(guò)程中起決定性作用。念珠菌種類(lèi)繁多，對(duì)人類(lèi)影響最大、致病力最強(qiáng)的是白念珠菌(以下簡(jiǎn)稱(chēng)白念)。機(jī)體免疫

3、有天然免疫(innateimmunity)和適應(yīng)性免疫(adaptiveimmunity)二種。前者包括巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞吞噬、殺傷入侵的病原微生物；后者是指T、B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，特異性和記憶性是其特征。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為天然免疫是非特異性免疫反應(yīng)，Janeway提出的模式識(shí)別理論讓我們改變了這個(gè)認(rèn)識(shí)，該理論將天然免疫針對(duì)的主要靶分子信號(hào)稱(chēng)作病原相關(guān)的分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，P

4、AMPs)，相對(duì)應(yīng)的識(shí)別受體稱(chēng)作模式識(shí)別受體(patternrecognitionreceptors，PRRs)，它可以特異性識(shí)別不同病原微生物表面的PAMPs。它們是很多微生物共有的、對(duì)病原體生存所必需的、在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的分子結(jié)構(gòu)，如酵母細(xì)胞壁成分甘露糖，各種細(xì)菌細(xì)胞壁成分脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、胞壁酸等。Toll作為果蠅體內(nèi)參與胚胎發(fā)育過(guò)程中背腹模式形成的一類(lèi)天然受體蛋白，不僅影響果蠅的胚胎發(fā)育，而且參與成蠅的免疫

5、反應(yīng)；Toll功能缺失的果蠅對(duì)真菌感染的易感性增高。哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)與Toll結(jié)構(gòu)和功能相似的同源體，稱(chēng)為T(mén)oll樣受體(Toll-likereceptors，TLRs)，目前在人類(lèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10個(gè)Toll樣受體家族成員，即TLR-1～TLR-10。它們是一類(lèi)與天然免疫密切相關(guān)的模式識(shí)別受體，不同的TLRs通過(guò)識(shí)別不同的PAMPs并傳遞識(shí)別信號(hào)，如：TLR-2能識(shí)別甘露糖(mannan)、肽聚糖(peptidoglycan，PGN)和胞壁

6、酸(lipoteichoicacid)等；TLR-3識(shí)別病毒雙鏈RNA(dsRNA)；TLR-4可識(shí)別細(xì)茵的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)；TLR-5識(shí)別細(xì)菌鞭毛蛋白(flagellin);TLR-9識(shí)別細(xì)菌胞嘧啶磷酸鳥(niǎo)苷(cytosinephosphateguanidineDNA，CpGDNA)；TLR-7和TLR-8的天然配體還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，但最近研究認(rèn)為它們參與微生物核酸樣結(jié)構(gòu)(nucleic-likestru

7、cture)的識(shí)別。 為進(jìn)一步了解角質(zhì)形成細(xì)胞在抗真菌感染免疫中的作用，加深白念珠菌與角質(zhì)形成細(xì)胞相互作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)。本課題擬作以下研究：通過(guò)檢測(cè)與真菌識(shí)別密切相關(guān)的Toll樣受體2(Toll-likereceptor2，TLR-2)和在皮膚天然免疫中起重要作用的β-防御素-2(humanbata-defensin-2，HBD-2)在角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)情況以及白念對(duì)它們表達(dá)的影響；白念對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NF-B(nuclearfa

8、ctor-κB，NF-κB)活性的影響；白念對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌白介素8(IL-8)的影響；角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)白念的殺傷活性；以及抗TLR-2抗體對(duì)IL-8分泌和殺白念活性的影響。 方法：(1)選用原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞、HaCaT細(xì)胞株和白念標(biāo)準(zhǔn)株作實(shí)驗(yàn)對(duì)象。 (2)取兒童包皮組織，分散酶(Dispase)分離表皮和真皮，用無(wú)血清培養(yǎng)基(KC-SFM)培養(yǎng)；顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并用廣譜抗角蛋白(cytokeratin，CK)

9、抗體的免疫組化染色鑒定細(xì)胞，建立角質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。 (3)用沙堡液體培養(yǎng)基培養(yǎng)白念，Lyticase酶解、反復(fù)凍融、超聲破碎和超速離心等方法制備白念菌體成分白念培養(yǎng)上清液、白念胞壁提取物、白念胞漿提取物；用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (reverse-transcriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)方法檢測(cè)白念、純甘露聚糖及其菌體成分刺激角質(zhì)形成細(xì)胞24h前后TLR-2mRNA、H

10、BD-2mRNA的變化，并進(jìn)行半定量分析，探討白念珠菌對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞TLR-2mRNA、HBD-2mRNA表達(dá)的影響。 (4)用白念、白念菌體成分和純甘露聚糖分別與角質(zhì)形成細(xì)胞共同培養(yǎng)1.5h和3h后，激光共聚焦掃描顯微鏡(Laserconfocalscanningmicroscope，LCSM)檢測(cè)細(xì)胞NF-κB的表達(dá)，探討白念珠菌對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞NF-B活性的影響。 (5)分別用白念及菌體成分刺激角質(zhì)形成細(xì)胞后，用酶聯(lián)

11、免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbnentassay，ELISA)檢測(cè)TLR-2作用被中和前后不同時(shí)間IL-8的變化；用亞甲蘭染色檢測(cè)TLR-2作用被中和前后細(xì)胞對(duì)白念的殺傷作用的影響，探討TLR-2對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞殺白念活性和分泌IL-8的影響。 結(jié)果：(1)分離得到純化的培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞，沒(méi)有成纖維細(xì)胞的混雜；鏡下細(xì)胞大小不一，呈多角形、鋪路石樣外觀，符合上皮細(xì)胞的典型形態(tài)；CK抗體的免疫組化染色，有

12、廣泛的胞漿表達(dá)，鑒定為角質(zhì)形成細(xì)胞；經(jīng)凍存、復(fù)蘇，可以穩(wěn)定地傳5～9代。 (2)發(fā)現(xiàn)角質(zhì)形成細(xì)胞有HBD-2和TLR-2mRNA的組成性表達(dá)，前者可被白念及其胞壁成分甘露聚糖誘導(dǎo)表達(dá)增強(qiáng)，而后者表達(dá)沒(méi)有變化。 (3)發(fā)現(xiàn)白念及胞壁成分可以誘導(dǎo)NF-κB向胞核內(nèi)移位。 (4)白念刺激角質(zhì)形成細(xì)胞引起IL-8分泌增加，TLR-2作用被中和后，IL-8分泌無(wú)明顯下降；角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)白念有殺傷作用，TLR-2作用被中和后