過表達(dá)GmDof4和GmDof11基因?qū)Ω仕{(lán)型油菜種子脂肪酸組分的影響.pdf

1、油菜是重要的油料作物，改善菜籽油的品質(zhì)和產(chǎn)量是油菜育種的一個(gè)重要方向。GmDof4和GmDof11基因是從大豆中克隆的與油脂合成相關(guān)的Dof(DNA binding with one finger)轉(zhuǎn)錄因子，參與大豆、擬南芥等種子油脂合成和積累，同時(shí)可能參與植物逆境脅迫應(yīng)答的調(diào)控。
　　本研究以甘藍(lán)型油菜“揚(yáng)油6號”為材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將GmDof4和GmDof11基因?qū)敫仕{(lán)型油菜中，分析GmDof4和GmDof

2、11基因的導(dǎo)入對各株系種子品質(zhì)性狀的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　1.對以子葉為外植體的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行了優(yōu)化。“揚(yáng)油6號”子葉外植體的愈傷分化率達(dá)到94.9％，生苗率達(dá)到71.4％。以“揚(yáng)油6號”子葉外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，最適Kan篩選濃度為40 mg/L。使用含有GUS報(bào)告基因的pCambia-1303載體轉(zhuǎn)化子葉外植體，并利用潮霉素作為篩選劑進(jìn)行轉(zhuǎn)基因苗的篩選。結(jié)果證明在侵染后第1周時(shí)各外植體的傷口以及子葉和子葉柄

3、處已經(jīng)出現(xiàn)GUS的表達(dá)，而對生長4周的顏色正常且生長健壯的愈傷組織進(jìn)行GUS染色后發(fā)現(xiàn)愈傷組織的大部分細(xì)胞為陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞。另外，我們獲得的11個(gè)35S:GUS轉(zhuǎn)基因苗中，6株為陽性，陽性率為54.5％。
　　2.利用以子葉為外植體的轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)行了2個(gè)GmDof基因過表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化，對獲得的再生苗進(jìn)行PCR及半定量RT-PCR鑒定。轉(zhuǎn)pBin438/GmDof4載體獲得的20株再生苗中PCR為陽性的有9株，其中6株檢測到表達(dá);

4、轉(zhuǎn)pBin438/GmDof11載體獲得的21株再生苗中有8株P(guān)CR呈陽性，其中有3株檢測到表達(dá)。
　　3.利用近紅外光譜技術(shù)(NIRS)對獲得的陽性轉(zhuǎn)基因株系T2代種子進(jìn)行營養(yǎng)成分的測定，與對照相比GmDof4和GmDof11轉(zhuǎn)基因株系種子中油脂、硫苷含量沒有顯著變化，其中GmDof4的一個(gè)過表達(dá)株系種子蛋白含量明顯降低。NIRS以及高效氣相色譜(GC)分析結(jié)果顯示各轉(zhuǎn)基因株系的脂肪酸比例發(fā)生了變化:與對照相比，轉(zhuǎn)基因株系中油酸

5、含量均明顯升高，亞油酸和亞麻酸含量降低。
　　4.利用qPCR分析了與蛋白和脂肪酸合成相關(guān)的基因表達(dá)，結(jié)果顯示accD基因的表達(dá)可以被GmDof4和GmDof11激活，但LACS表達(dá)無變化;過表達(dá)GmDof4可以誘導(dǎo)FAB2、FAD8的表達(dá);而過表達(dá)GmDof11可以抑制FAD2、FAD6的表達(dá);此外CRA1基因的表達(dá)可能也受到GmDof4的誘導(dǎo)。
　　5.利用酵母單雜交技術(shù)驗(yàn)證上述候選基因是否受GmDof蛋白的直接調(diào)控，結(jié)