HO-1系統(tǒng)對(duì)小鼠免疫細(xì)胞功能的影響.pdf

1、本文主要從以下幾方面展開(kāi)論述：
　　第一部分
　　目的：研究小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞及淋巴細(xì)胞各亞群的HO-1表達(dá)，并研究HO-1特異性誘導(dǎo)劑對(duì)不同成熟度樹(shù)突狀細(xì)胞的效應(yīng)。
　　方法：分離培養(yǎng)小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)比較懸浮樹(shù)突狀細(xì)胞及貼壁樹(shù)突狀細(xì)胞表型差異以及HO-1表達(dá)水平差異；分別使用50uM CoPP和SnPP與貼壁未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞共同孵育2h，采免疫印跡法和流式細(xì)胞術(shù)比較上述幾群細(xì)胞HO-1表達(dá)水平差

2、異；LPS刺激細(xì)胞成熟，隨后加入CoPP孵育，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CoPP孵育前后細(xì)胞表型及HO-1表達(dá)水平差異；磁珠分選CD4+細(xì)胞，使用CD3/CD28刺激2d為效應(yīng)T細(xì)胞，磁珠分選CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞及CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞及CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞、CD4+效應(yīng)T細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞和CD19+B淋巴細(xì)胞HO-1表達(dá)水平。
　　結(jié)果：貼壁樹(shù)突狀細(xì)胞共刺激分子表

3、達(dá)較低，HO-1表達(dá)更高（平均熒光強(qiáng)度41.4 Vs.26.5）；CoPP可以誘導(dǎo)未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞高表達(dá) HO-1(P<0.05)，但是對(duì)成熟 DC沒(méi)有影響；CD4+CD25+Treg及激活后的CD4+T細(xì)胞均表達(dá)HO-1，而在CD8+T淋巴細(xì)胞和CD19+B淋巴細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。
　　結(jié)論：CoPP可以增加未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞HO-1表達(dá)，但不能增加成熟樹(shù)突狀細(xì)胞HO-1的表達(dá)。HO-1在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和活化后的效應(yīng)細(xì)胞中表達(dá)。

4、>　　第二部分
　　目的：研究HO-1對(duì)小鼠未成熟樹(shù)突狀的成熟能、免疫調(diào)節(jié)能力及誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的能力的影響。
　　方法：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) CoPP或SnPP孵育未成熟貼壁樹(shù)突狀細(xì)胞后表型及刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖能力的變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LPS刺激CoPP孵育后的樹(shù)突狀細(xì)胞的表型變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CoPP或SnPP孵育后貼壁樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)CD3/CD28刺激的淋巴細(xì)胞增殖的抑制能力變化，并使用 Transwell判斷樹(shù)突狀細(xì)

5、胞的抑制能力是否依賴(lài)細(xì)胞接觸。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CoPP或SnPP孵育后貼壁DC對(duì)Treg誘導(dǎo)能力的變化。
　　結(jié)果：CoPP或SnPP孵育未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞后低表達(dá)MHCII/CD80/CD86,刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖能力均很弱。CoPP處理后的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞經(jīng) LPS刺激后，MHCII/CD80與MHCII/CD86雙陽(yáng)性細(xì)胞分別為20.09％和10.15％，而未經(jīng)CoPP處理的樹(shù)突狀細(xì)胞經(jīng) LPS刺激后，MHCII/CD80與

6、 MHCII/CD86雙陽(yáng)性細(xì)胞分別為45.47％和31.59％?？剐∈驝D3/CD28抗體可明顯刺激淋巴細(xì)胞增殖，其中CD4+細(xì)胞增殖85.3％，CD8+細(xì)胞增殖81.5％。加入未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞后可明顯抑制淋巴細(xì)胞增殖，且隨抑制細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞比例下降，其抑制能力隨之減弱。在抑制細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞比例為1:16時(shí)，未處理組、CoPP處理組、SnPP處理組中CD4+細(xì)胞增殖比例分別為48.1％、31.6％和61.6％，CD8+細(xì)胞增殖比例分別

7、為57.8％、38.9％和70.5％。加入Transwell后，樹(shù)突狀細(xì)胞抑制能力消失。CoPP處理組樹(shù)突狀細(xì)胞與未處理組誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能力接近，分別為20％和22％，但是SnPP處理組誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能力下降，比例僅為12％。
　　結(jié)論：誘導(dǎo)未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞高表達(dá)HO-1可增強(qiáng)其抵御成熟的能力及抑制T細(xì)胞增殖的能力。樹(shù)突狀細(xì)胞抑制增殖的能力依賴(lài)于細(xì)胞接觸。抑制未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞 HO-1活性可抑制其誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的能力。

8、>　　第三部分
　　目的：研究一氧化碳對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響。
　　方法：將100uM一氧化碳釋放分子（CORM-2）與未分選淋巴細(xì)胞、磁珠分選 CD4+淋巴細(xì)胞和磁珠分選CD4+CD25-細(xì)胞孵育，隨后用抗小鼠CD3/CD28抗體刺激淋巴細(xì)胞增殖，2至3天后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖情況。
　　結(jié)果：根據(jù)淋巴細(xì)胞干預(yù)方式分為：空白對(duì)照組，iCORM-2對(duì)照組及CORM-2實(shí)驗(yàn)組。反應(yīng)細(xì)胞為淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞時(shí)，與100

9、uM CORM-2共同孵育后，在CD3/CD28的刺激作用下基本不增殖。而兩對(duì)照組淋巴細(xì)胞在CD3/CD28刺激3天后CD4+淋巴細(xì)胞與CD8+淋巴細(xì)胞均增殖85％以上。反應(yīng)細(xì)胞為分選后CD4+淋巴細(xì)胞時(shí)，在CD3/CD28的刺激2天后，實(shí)驗(yàn)組有35％的CD4+淋巴細(xì)胞增殖，對(duì)照組達(dá)到70％左右。當(dāng)CD3/CD28刺激3天后，CD4+淋巴細(xì)胞增殖細(xì)胞比例進(jìn)一步增加，達(dá)到57％，兩個(gè)對(duì)照組細(xì)胞比例大于65％。反應(yīng)細(xì)胞為分選后 CD4+CD

10、25-淋巴細(xì)胞時(shí)，在CD3/CD28的刺激2天后增殖較少，實(shí)驗(yàn)組有23％的CD4+淋巴細(xì)胞增殖。而iCORM-2組與未處理組淋巴細(xì)胞增殖均達(dá)到35％以上。當(dāng)CD3/CD28刺激3天后，CD4+CD25-淋巴細(xì)胞增殖細(xì)胞比例為10％，兩個(gè)對(duì)照組細(xì)胞比例約為50％。
　　結(jié)論：CO對(duì)CD3/CD28刺激的未分選淋巴細(xì)胞、分選后 CD4+淋巴細(xì)胞及分選后CD4+CD25-淋巴細(xì)胞增殖均有顯著抑制效應(yīng)。
　　第四部分
　　目的

11、：研究CO對(duì)小鼠未成熟樹(shù)突狀成熟能力及免疫調(diào)節(jié)能力的影響。
　　方法：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CORM-2或iCORM-2孵育未成熟貼壁樹(shù)突狀細(xì)胞后表型變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LPS刺激CORM-2或iCORM-2孵育樹(shù)突狀后表型變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CORM-2或iCORM-2孵育后貼壁樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)CD3/CD28刺激的淋巴細(xì)胞增殖的抑制能力變化。
　　結(jié)果：經(jīng)過(guò)iCORM-2或CORM-2處理后的貼壁樹(shù)突狀細(xì)胞共刺激分子表達(dá)均無(wú)明顯變化

12、，MHC/CD40、MHCII/CD80與 MHCII/CD86雙陽(yáng)性細(xì)胞比例均在2％以下。CORM-2處理后的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞經(jīng) LPS刺激后，MHC/CD40、MHCII/CD80與MHCII/CD86雙陽(yáng)性細(xì)胞分別為19.8％、0.4％、8.88％。而無(wú)任何預(yù)處理的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞LPS刺激后MHCII/CD40、MHCII/CD80、MHCII/CD86雙陽(yáng)性的細(xì)胞可達(dá)34.3％、26.2％和36.1％。預(yù)先給予iCORM-2再

13、使用LPS刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞各項(xiàng)指標(biāo)與成熟樹(shù)突狀細(xì)胞相似，雙性細(xì)胞比例分別40.5％、27.8％和38.3％。CD3/CD28可以刺激T細(xì)胞活化，共同培養(yǎng)三天后，CD4+細(xì)胞與CD8+細(xì)胞分別增殖81％和78.1％。加入未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞后增殖能力大大降低。當(dāng)抑制細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞比例為1:4時(shí)，各組抑制效應(yīng)最強(qiáng)，其中空白對(duì)照組貼壁未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞、iCORM-2對(duì)照組、CORM-2實(shí)驗(yàn)組CD4+細(xì)胞增殖比例分別為33.9％，45.2％和51.