芍藥類黃酮合成相關基因載體構(gòu)建及對模式植物轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、花卉植物的花色直接影響了其觀賞價值，是花卉育種的焦點。芍藥（Paeonia lactiflora）屬于芍藥科芍藥屬，是具有可觀的商品價值的觀賞植物，但其顏色主要集中在粉色、紅色、紫色、白色系，黃色系等品種非常稀少，這在一定程度上限制了其發(fā)展。對芍藥花色的改良創(chuàng)新一直備受關注，主要報道集中在雜交育種，利用基因工程手段進行花色定向選育的研究受到限制，可能由于目前對芍藥花色形成的分子機理了解甚少，同時相關基因的調(diào)節(jié)機制無深刻的認識。與花色密切

2、相關的類黃酮合成途徑中的許多關鍵基因已在許多植物中進行了克隆研究，因此，本研究基于課題組前期對芍藥嵌合體品種花瓣的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，在明確CHI、ANS、DFR、FLS、PAL基因均為調(diào)控芍藥類黃酮合成途徑中調(diào)控花色的關鍵基因之后，克隆獲得目的基因，并構(gòu)建這五個基因的表達載體，以農(nóng)桿菌為介導轉(zhuǎn)化模式植物，以期對其功能進行初步探索，為開發(fā)芍藥新品種和新異花色的分子育種提供可靠的理論依據(jù)和實踐意義。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)克隆了芍

3、藥類黃酮途徑相關基因。提取芍藥‘粉玉樓’花瓣總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，根據(jù)課題組前期對相關基因的RACE結(jié)果，克隆獲得五個目的基因CHI、ANS、DFR、FLS、PAL,均包含完整編碼區(qū)，推測氨基酸序列相似性與NCBI數(shù)據(jù)庫分別達99％、98％、99％、100％、100％。
　　(2)構(gòu)建了芍藥類黃酮途徑相關基因超表達載體。在擴增獲得帶有合適的酶切位點的編碼區(qū)后，用SmaⅠ和SacⅠ雙酶切目的基因CHI、ANS、DFR、

4、PAL和表達載體質(zhì)粒pCAMBIA1301，用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切目的基因FLS和表達載體質(zhì)粒pCAMBIA1301，回收、連接目的片段與載體，分別成功構(gòu)建植物超表達載體pB1301-CHI、pB1301-ANS、pB1301-DFR、pB1301-FLS、pB1301-PAL共5個。測序驗證后，采用凍融法將重組質(zhì)粒以及空載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，獲得了用于植物轉(zhuǎn)化的材料。
　　(3)獲得純合轉(zhuǎn)CHI、ANS、DFR、FL

5、S、PAL基因擬南芥。利用農(nóng)桿菌介導Floral-dip法將目的基因CHI、ANS、DFR、FLS、PAL和空載體導入擬南芥，經(jīng)過T1代抗性篩選、GUS組織化學染色、T2和T3代分離比篩選，最終獲得轉(zhuǎn)CHI基因純合株系6個，轉(zhuǎn)ANS基因純合株系2個，轉(zhuǎn)DFR基因純合株系6個，轉(zhuǎn)FLS基因純合株系3個，轉(zhuǎn)PAL基因純合株系5個，以及純合的轉(zhuǎn)空載株系2個。GUS染色、PCR鑒定及qRT-PCR分析顯示，純合轉(zhuǎn)基因擬南芥均能在基因組中檢測到目

6、的基因，相對于對照組在轉(zhuǎn)錄水平表達水平明顯提高。
　　(4)純合轉(zhuǎn)基因擬南芥表型初步分析。對轉(zhuǎn)基因株系的初步觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)CHI、FLS及PAL基因擬南芥與對照組相比，均無顯著差異。轉(zhuǎn)DFR和ANS基因的株系，雖然花器官與對照組相比無明顯差異，但在抽薹期，轉(zhuǎn)ANS基因株系部分蓮座葉葉背斑塊狀發(fā)紅，主脈基部略微發(fā)紅。轉(zhuǎn)DFR基因株系蓮座葉均葉色較深，部分葉片葉背發(fā)紅，DFR表達量最高的株系2葉背為深紫紅色。對轉(zhuǎn)基因各株系總黃酮與花色苷

7、含量的測定有待進一步研究。
　　(5)獲得轉(zhuǎn)DFR、FLS基因煙草植株。利用農(nóng)桿菌介導葉盤法將目的基因DFR、FLS和空載體導入煙草，通過抗性篩選，獲得轉(zhuǎn)DFR基因植株43株，轉(zhuǎn)FLS基因植株66株，轉(zhuǎn)空載對照5株。通過GUS組織化學染色、PCR鑒定，隨機挑選的10株轉(zhuǎn)DFR基因煙草中陽性植株為8株，12株轉(zhuǎn)FLS基因煙草中陽性植株為7株，可認為目的基因已整合進入煙草基因組。通過qRT-PCR對陽性煙草中目的基因的轉(zhuǎn)錄水平進行分析