chi、rip、DREB1A基因多價(jià)植物表達(dá)載體構(gòu)建及對(duì)黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、黃瓜在我國蔬菜周年供應(yīng)上占有重要地位，但因真菌病害的危害每年都有不同程度的減產(chǎn)。目前采用最多的化學(xué)防治手段雖取得了一定功效，但卻帶來了嚴(yán)重的環(huán)境污染、生態(tài)失調(diào)和危害人類健康等弊端。隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的日趨成熟，利用基因工程手段進(jìn)行抗病分子育種已成為可能?！　∞D(zhuǎn)錄因子DREB1A是在擬南芥中克隆并鑒定的，它能在干旱、低溫及高鹽脅迫條件下調(diào)控報(bào)道基因的表達(dá)，并在上述逆境脅迫信號(hào)傳遞中起重要作用。由于DREB1A轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控植

2、物自身內(nèi)源多個(gè)與植物干旱、低溫及高鹽耐性有關(guān)的功能基因的表達(dá)，因此，利用轉(zhuǎn)錄因子來改良植物抗逆性與單基因的遺傳轉(zhuǎn)化相比有明顯優(yōu)勢(shì)。擬南芥rd29A啟動(dòng)子的表達(dá)受到干早、低溫和高鹽的誘導(dǎo)，因?yàn)樵谒膯?dòng)子區(qū)域中，有兩個(gè)與上述環(huán)境脅迫應(yīng)答有關(guān)的DRE順式作用元件，是植物抗逆基因工程研究中理想的逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子?！　∫虼?，本研究以黃瓜為試材，建立黃瓜植株再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系；構(gòu)建了分別由雙35S組成型啟動(dòng)子、E12強(qiáng)組成型啟動(dòng)子和rd29

3、A誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控的核糖體失活蛋白基因、幾丁質(zhì)酶基因和DREB1A基因的多價(jià)基因植物表達(dá)載體；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其導(dǎo)入黃瓜優(yōu)良品種，獲得了轉(zhuǎn)pBDCRT0及T1代PCR陽性植株。T1代轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性實(shí)驗(yàn)表明，DREB1A基因的表達(dá)可以提高黃瓜的抗旱性。本研究為培育抗逆境及抗真菌病轉(zhuǎn)基因植株探索途徑，并為進(jìn)一步揭示核糖體失活蛋白基因、幾丁質(zhì)酶基因和DREB1A基因的分子機(jī)理提供了理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：(1)植物表達(dá)載體構(gòu)建　　

4、構(gòu)建了分別由雙35S組成型啟動(dòng)子、E12強(qiáng)組成型啟動(dòng)子和rd29A誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控的核糖體失活蛋白基因、幾丁質(zhì)酶基因和DREB1A基因的多價(jià)基因植物表達(dá)載體，并命名為pBDCR。(2)黃瓜植株再生體系建立　?、俅_定了黃瓜“津研四號(hào)”不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+1mg/LBA，30g/LSuc，0.8％Agar,　　pH5.8；②不同基因型的不定芽分化率、平均每塊外植體芽數(shù)及分化效率不同：“長春密刺”、“津　　研四號(hào)”不定芽分化率分別

5、為85.8％、69.7％，平均每塊外植體芽數(shù)分別為3.9、　　3.4，分化效率分別為334.6％和236.9％。(3)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系建立　?、俅_定了“津研四號(hào)”在不定芽分化階段Km的篩選壓力為25mg/L。②獲得了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化pBDCR的“長春密刺”抗性植株，抗性芽率為39.79％；獲得　　了轉(zhuǎn)化pBDCR的“津研四號(hào)”抗性植株，抗性芽率為25.39％。(4)轉(zhuǎn)基因植株的分子生物學(xué)檢測(cè)①獲得了轉(zhuǎn)化pBDCR的“長春密

6、刺"PCR陽性植株檢測(cè)轉(zhuǎn)化pBDCR的抗性植株142　　株，得到41株P(guān)CR陽性植株，PCR陽性率為28.87％。其中chi、rip、DREB1A的　　PCR陽性植株數(shù)分別為57、50、53株。三個(gè)基因的PCR陽性率分別為40.14％、　　35.21％、37.32％。②獲得了轉(zhuǎn)化pBDCR的“津研四號(hào)"PCR陽性植株檢測(cè)轉(zhuǎn)化pBDCR的抗性植株151　　株，得到46株P(guān)CR陽性植株，PCR陽性率為30.46％。其中chi、rip

7、、DREB1A的　　PCR陽性植株數(shù)分別為57、52、65株。其中三個(gè)基因的PCR陽性率分別為37.75％、　　34.44％、43.05％。③不同基因型對(duì)轉(zhuǎn)pBDCR的轉(zhuǎn)化效率不同：“長春密刺”轉(zhuǎn)pBDCR的轉(zhuǎn)化效率為　　11.49％，“津研四號(hào)”轉(zhuǎn)pBDCR的轉(zhuǎn)化效率為7.73％。④獲得了轉(zhuǎn)化pBDCR的“長春密刺’T1代PCR陽性植株對(duì)“長春密刺"Ti代20個(gè)株系　　進(jìn)行PCR檢測(cè)，共377株，其中有4個(gè)株系均未擴(kuò)出目的帶。

8、在擴(kuò)出目的帶的株系中，　　其中DREB1A基因PCR陽性植株共有75株，PCR陽性率為19.89％；chi基因和rip　　基因PCR陽性植株共有45株，PCR陽性率為11.94％。(5)轉(zhuǎn)基因植株的生物學(xué)檢測(cè)①對(duì)“長春密刺”T1代PCR陽性植株抗逆性實(shí)驗(yàn)證明，DREB1A基因能夠有效提高轉(zhuǎn)基　　因黃瓜的抗旱性，對(duì)6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系及一組陰性對(duì)照進(jìn)行脯氨酸的測(cè)定結(jié)果表明。陰性　　對(duì)照干旱前后脯氨酸含量增加百分比為29.51％，而轉(zhuǎn)基因