進(jìn)一步降低肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的實(shí)驗(yàn)及臨床研究.pdf

1、第一部分進(jìn)一步降低肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的實(shí)驗(yàn)研究
　　 第一章SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及標(biāo)記
　　 目的：
　　 探討SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記。
　　 方法：
　　 通過密度梯度離心法和貼壁法分離、培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀通過細(xì)胞的表面抗原對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并采用Brdu進(jìn)行標(biāo)記。
　　 結(jié)論：
　　 采用密度梯度離心法和貼壁法分

2、離SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞簡(jiǎn)單易行，細(xì)胞純度較高，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定，確定為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。采用Brdu標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，簡(jiǎn)單、可行，便于進(jìn)一步深入研究。
　　 第二章攜帶VEGF165的腺病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
　　 目的：
　　 用攜帶VEGF165基因的腺病毒轉(zhuǎn)染MSC(mesenchymal stem cells)，并檢測(cè)目的基因VEGF165的表達(dá)情況，為下一步的深入研究奠定基礎(chǔ)。
　　

3、方法：
　　 腺病毒感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。先用攜帶GFP的腺病毒感染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，確定出最佳的感染倍數(shù)。根據(jù)最佳感染倍數(shù)，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，MSC被隨機(jī)分為兩組：實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染攜帶VEGF165基因的腺病毒載體，對(duì)照組轉(zhuǎn)染空的病毒載體。通過ELISA、RT-PCR和Western blot法檢測(cè)VEGF165的表達(dá)情況，MTT法繪制轉(zhuǎn)染后的MSC的生長(zhǎng)曲線。
　　

4、 結(jié)論：
　　 攜帶VEGF165腺病毒載體，能成功感染了MSC，當(dāng)MOI值在100時(shí)，感染效率接近90％，且對(duì)細(xì)胞的影響較小。感染后的MSC能夠表達(dá)目的蛋白VEGF，轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞較對(duì)照組生長(zhǎng)較快。
　　 第三章無心跳大鼠供肝膽道熱缺血再灌注損傷的安全時(shí)限
　　 目的：
　　 探討非肝素化的無心跳大鼠供肝不同的熱缺血時(shí)間與膽道缺血再灌注損傷之間的關(guān)系。
　　 方法：
　　 采用改良的重建

5、肝動(dòng)脈的大鼠肝移植模型，供體采用無心跳，無肝素化的模型，按供肝的熱缺血時(shí)間的不同分別為0分鐘(WI0組)，10分鐘(WI10組)，15分鐘(WI15組)三組，每組36對(duì)大鼠。比較大鼠肝移植術(shù)后的生存率，膽道并發(fā)癥發(fā)生率，肝功能恢復(fù)情況以及病理改變情況。
　　 結(jié)論：
　　 非肝素化無心跳的大鼠供肝熱缺血時(shí)間超過15分鐘時(shí)，移植術(shù)后膽道損傷明顯，可導(dǎo)致不可逆改變。
　　 第四章攜帶VEGF165基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)

6、胞對(duì)無心跳大鼠供肝膽道熱缺血再灌注損傷修復(fù)的研究
　　 目的：
　　 觀察經(jīng)肝動(dòng)脈輸注轉(zhuǎn)染VEGF165的MSC和單純的MSC，對(duì)大鼠無心跳供肝膽道熱缺血再灌注損傷的修復(fù)及血管生成情況，并比較聯(lián)合治療組與單獨(dú)細(xì)胞移植治療組之間的療效差異。
　　 方法：
　　 采用無肝素化、無心跳熱缺血供體模型和重建肝動(dòng)脈的大鼠肝移植模型，供肝的熱缺血時(shí)間控制在15分鐘，隨后將大鼠隨機(jī)分為4組(每組24對(duì))，行肝移植手術(shù)，

7、A組(聯(lián)合治療組)在術(shù)中由肝動(dòng)脈輸注經(jīng)肝動(dòng)脈注入轉(zhuǎn)染VEGF165的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞懸液0.5ml(細(xì)胞數(shù)為3×106個(gè)/ml)，B組(細(xì)胞治療組)進(jìn)行等量的MSC移植，C組(對(duì)照組)輸入PBS0.5ml。另取6只為假手術(shù)組(D組)。比較大鼠肝移植術(shù)后的生存率、肝功能恢復(fù)情況、體重、膽道并發(fā)癥發(fā)生率。1周時(shí)觀察MSC在肝臟的分布情況，2周時(shí)用RT-PCR及Western blot檢測(cè)VEGF在體內(nèi)的表達(dá)情況，2周時(shí)檢測(cè)膽管的增生情況，4周

8、時(shí)用八因子抗體行免疫組化檢測(cè)微血管密度，同時(shí)檢測(cè)膽管數(shù)目的多少，并行MASSON染色。
　　 結(jié)論：
　　 經(jīng)肝動(dòng)脈輸注骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及轉(zhuǎn)染VEGF165的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，能夠促進(jìn)肝功能恢復(fù)，減少膽道并發(fā)癥，降低死亡率，通過促進(jìn)血管生成及微循環(huán)得到明顯的改善，有利于膽道熱缺血再灌注損傷的修復(fù)，但聯(lián)合組的療效要好于單純細(xì)胞治療組，考慮可能與VEGF與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞之間的協(xié)同作用有關(guān)。
　　 第二部分進(jìn)一步降低

9、肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的臨床研究
　　 第一章改良膽道重建技術(shù)在肝移植手術(shù)中的應(yīng)用
　　 目的：
　　 探討改良膽道重建技術(shù)在肝移植手術(shù)中應(yīng)用的可行性、優(yōu)勢(shì)。
　　 方法：
　　 回顧分析本院兩年間完成的131例肝移植患者的臨床資料。根據(jù)膽道重建方式的不同將其分為兩組：A組(n=76)為接受傳統(tǒng)膽道重建術(shù)的患者，B組(n=55)為接受改良膽道重建技術(shù)的患者。改良膽道重建最主要的特點(diǎn)是利用供肝獲取時(shí)的

10、膽囊灌注管或膽道重建時(shí)的膽道支架管，來改善膽道重建的條件，便于吻合且方便試漏。所有手術(shù)為同一組術(shù)者實(shí)施，且手術(shù)技術(shù)熟練。兩組患者在性別，年齡，手術(shù)指征及肝功能評(píng)分等方面均相似，具有可比性。比較兩組患者的膽道吻合時(shí)間，與吻合口相關(guān)的膽道并發(fā)癥等情況。
　　 結(jié)論：
　　 利用膽囊灌注管或膽道支架管并結(jié)合精細(xì)的顯微外科技術(shù)來改善膽道重建的方法是一種較理想的膽道重建方式，簡(jiǎn)便易行，術(shù)后膽道并發(fā)癥少。
　　 第二章肝移植

11、術(shù)中復(fù)雜膽道重建的處理
　　 目的：
　　 探討肝移植中復(fù)雜膽道重建的方法及體會(huì)，提高膽道重建的技術(shù)。
　　 方法：
　　 對(duì)2007年到2009年的資料完整的9例復(fù)雜性膽道重建病例的臨床資料進(jìn)行分析。9例患者中有手術(shù)史的患者有5例(55.6％)，其中膽道手術(shù)史的3例(33.33％)；活體肝移植2例(22.22％)；膽管癌1例(11.1％)；胰頭癌1例(11.1％)。評(píng)價(jià)膽道重建的時(shí)間，膽道重建的方式，術(shù)

12、中處理，術(shù)后并發(fā)癥等資料。
　　 結(jié)論：
　　 對(duì)于肝移植中復(fù)雜的膽道重建要做好充分的準(zhǔn)備，嫻熟的顯微外科技術(shù)及適當(dāng)?shù)闹亟ǚ绞椒浅Ｖ匾糁媚懙乐Ъ芄苁前踩?、可行的?br>　　 第三章肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的診治體會(huì)
　　 目的：
　　 探討肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的診治體會(huì)。
　　 方法：
　　 對(duì)2007年到2009年的資料完整的23例肝移植術(shù)后不同類型的膽道并發(fā)癥的患者臨床資料進(jìn)行分析