人源抗TLR4基因工程抗體Fab的制備、表達(dá)及特性分析.pdf

1、TLR4是Toll樣受體家族成員之一,在對TLR4的研究中發(fā)現(xiàn)TLR4通過依耐MyD88途徑或不依耐MyD88途徑介導(dǎo)LPS的信號(hào)傳導(dǎo),從而在病原體入侵機(jī)體的早期即可啟動(dòng)免疫,其在抗感染治療中起非常關(guān)鍵的作用[1-4]。阻斷TLR4介導(dǎo)的內(nèi)毒素信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)的傳導(dǎo),是減輕內(nèi)毒素生物學(xué)效應(yīng)的有效的方法。本課題前期進(jìn)行的鼠源性的抗 TLR4抗體的研究中,獲得鼠抗人TLR4的單克隆抗體,體外細(xì)胞試驗(yàn)顯示其對LPS刺激產(chǎn)生的a-TNF有明顯的抑制

2、作用[5]。但人體對鼠源性抗體會(huì)產(chǎn)生HAMA(human anti-mouse antibody),產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng),限制了其臨床應(yīng)用。噬菌體抗體庫展示技術(shù)是近年發(fā)展的單克隆抗體制備的一項(xiàng)新技術(shù),它改變了單克隆抗體制備的傳統(tǒng)途徑,它模擬機(jī)體產(chǎn)生抗體的過程,從而使得在體外就可以獲得特異性的單克隆抗體[6]。本課題運(yùn)用噬菌體抗體庫技術(shù)在人體庫中進(jìn)行篩選,成功獲得了人源抗TLR4抗體的Fab的基因片段,并構(gòu)建該Fab的原核表達(dá)載體,對其表達(dá)

3、的蛋白進(jìn)行活性分析。
　　方法:
　　1、采用抗原固相篩選法:以純化的重組hTLR4蛋白為靶抗原,從人源噬菌體Fab抗體庫中篩選,經(jīng)“吸附、洗脫和擴(kuò)增”三個(gè)環(huán)節(jié),經(jīng)五輪篩選后,隨機(jī)挑取的80個(gè)克隆,經(jīng)phage ELISA驗(yàn)證,獲得11株陽性克隆,對陽性克隆進(jìn)行測序,發(fā)現(xiàn)11株陽性克隆的抗體可變區(qū)基因序列相同,最終獲得一株人源抗 TLR4抗體 Fab,將其命名為抗hTLR4Fab-1。
　　2、將篩選獲得的陽性克隆質(zhì)粒

4、經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得VL和Fd,構(gòu)建pET-Duet1表達(dá)載體,將重新構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Origami2(DE3),誘導(dǎo)其表達(dá)抗hTLR4Fab-1。
　　3、將誘導(dǎo)表達(dá)的抗hTLR4Fab-1包涵體蛋白經(jīng)變性、復(fù)性后,用Protein L柱純化,純化后抗體Fab經(jīng)SDS-PAGE、Western-bolt及ELISA分析鑒定。
　　4、通過細(xì)胞學(xué)檢測抗hTLR4Fab-1對LPS誘導(dǎo)的人PBMC的TNF-α表達(dá)的影響,觀

5、察該抗體是否能阻斷hTLR4對LPS的信號(hào)傳導(dǎo),減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),判斷其活性。
　　結(jié)果:
　　1、將篩選獲得的11株陽性克隆擴(kuò)增后,進(jìn)行核酸序列測定和比對分析,結(jié)果顯示,所得到的陽性克隆的抗體可變區(qū)基因相同,其可變區(qū)基因序列正確。通過五輪篩選,獲得一株人源抗TLR4抗體Fab,命名為抗hTLR4Fab-1。
　　2、抗hTLR4Fab-1表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌,抗體以包涵體的形式大量表達(dá),經(jīng)變性、復(fù)性后,VL及

6、Fd能正確的組裝;經(jīng)Protein L柱純化后,可獲得純度較高的抗體。
　　3、ELISA結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)方法獲得的抗體能夠與hTLR4特異性結(jié)合。
　　4、體外細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果實(shí)驗(yàn)表明:人源抗體hTLR4Fab-1能夠明顯阻斷LPS誘導(dǎo)的人PBMC細(xì)胞表達(dá)TNF-α,抑制率達(dá)76.25％。
　　結(jié)論:
　　1、通過噬菌體抗體庫技術(shù),采用固相篩選方法可獲得抗hTLR4的特異性基因工程抗體Fab。
　　2、應(yīng)用

7、原核表達(dá)技術(shù),該Fab在大腸桿菌Origami2(DE3)中以包涵體的形式大量表達(dá)。通過優(yōu)選條件,對包涵體蛋白進(jìn)行變性、復(fù)性、純化,最終獲得高純度、有生物學(xué)活性的抗體。
　　3、抗hTLR4抗體片段Fab能與hTLR4特異性結(jié)合,并可抑制LPS誘導(dǎo)的人PBMC細(xì)胞表達(dá)TNF-α,減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
　　本研究制備的人源抗體 TLR4抗體 Fab可與 hTLR4特異性結(jié)合,并能有效阻斷 LPS誘導(dǎo)的人PBMC細(xì)胞表達(dá)T