抗惡性瘧原蟲特異性人源抗體Fab片段的制備和研究.pdf

1、目的：利用抗體庫技術(shù)及大腸桿菌表達系統(tǒng)，制備抗惡性瘧原蟲人源抗體，為研制瘧疾治療性抗體提供部分理論和實驗依據(jù)。
　　 方法：首先選擇位于惡性瘧原蟲裂殖子表面、參與蟲體入侵宿主紅細胞的蛋白分子MSP119作為抗體庫篩選的靶的抗原，應用DNA重組技術(shù)將擴增得到的Pfmsp119基因克隆入原核表達載體pET19b中，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21 Star(DE3)(pLysS)、誘導表達重組蛋白，金屬螯合親和層析純化重組蛋白，以酶聯(lián)免疫吸附試驗

2、(ELISA)檢測該重組蛋白的抗原特異性。分離惡性瘧患者的外周血淋巴細胞，利用工程抗體技術(shù)構(gòu)建具有一定庫容量的人抗惡性瘧原蟲免疫球蛋白G基因文庫。采用克隆印跡法、ELISA、間接免疫熒光反應(IFA)等多種方法以重組蛋白對抗體庫進行較大規(guī)模的篩選驗證，對所得陽性克隆進行測序和結(jié)構(gòu)分析。對陽性克隆進行大量表達，并以金屬螯合親和層析法進行純化，經(jīng)ELSIA、免疫印跡、IFA等檢測純化Fab片段能否特異性識別天然及重組惡性瘧原蟲表面抗原。Bi

3、acore檢測純化Fab片段的親和力，體外抑制實驗檢測其是否具有抑制惡性瘧原蟲裂殖子入侵宿主紅細胞的功能。利用定點突變技術(shù)對重組抗體進行改造以期提高該抗體的親和力。
　　 結(jié)果：應用DNA重組技術(shù)獲得了高純度的MSP119重組蛋白2mg/100ml培養(yǎng)液，能被抗惡性瘧原蟲蟲特異性抗體的血清識別、具有抗原特異性。構(gòu)建了庫容量為5×107的人抗惡性瘧原蟲抗體庫。對抗體庫經(jīng)過多輪篩選，從8×105個克隆中篩到兩個陽性克隆，分別命名為P

4、f25、Pf227；Pf25的重鏈可變區(qū)近似系為VH1-8、基因同源性為97％，輕鏈可變區(qū)近似系為A27、基因同源性為100％；Pf227的重鏈可變區(qū)近似系為VH1-8、基因同源性為98％，輕鏈可變區(qū)近似系為A27、基因同源性為99％。分別對兩個陽性克隆進行表達純化，得到重輕鏈結(jié)構(gòu)完整、純度較高的抗體Fab片段，均可特異性識別天然及重組惡性瘧原蟲表面抗原。Biacore檢測顯示，Pf25的解離常數(shù)為1.09×10-9M，Pf227的解離