pegfp-pdx-1真核表達(dá)載體的構(gòu)建

1、軍 c a d 醫(yī) P L 進(jìn) A 修g 學(xué) M 院 e d 學(xué) 報 2 o o 5D e c． 2 6 ( 6 ) A c a dJP L AP o s t g r a dM e dS c h? ? [ 文章編號] 1 0 0 5 - 1 1 3 9 ( 2 0 0 5 ) 0 6 - 0 4 2 1 - 0 3p E G F P - P D X - 1 真核表達(dá)載體 的構(gòu)建 孫曉艷 ， 衛(wèi) 勃 ， 安 靚 ( 1 ． 解放軍

2、總醫(yī)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 北京 1 0 0 8 5 3 ； 2 ． 解放軍總醫(yī)院普外科， 北京 1 0 0 8 5 3 ；3 ． 南方醫(yī)科大學(xué) 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 ， 廣州 5 1 0 5 1 5 )· 4 2 1·[ 摘要]目的： 構(gòu)建真核表達(dá)載體 p E G F P - P D X - 1 ， 為基因水平研究 P D X - 1 在肝干細(xì)胞定向分化中的調(diào)控機制 提供理論參考。方法： 參考分子克隆技術(shù)， 采用 P

3、 C R的方法從 S K 9 0 0 ／ B L S C R I F F 質(zhì)粒中擴(kuò)增 P D X ． 1 ， 同時將一個單 個限制性酶切位點連接反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)橐?H i n d m和B a m HI 為末端的雙限制性內(nèi)切酶位點連接反應(yīng)， 將 P D X ． 1e D N A定向插入 p E G F P - C 1 的多克隆位點中， 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 p E G F P - C 1 - P D X - 1 ， 并對重組子進(jìn)行 S m aI 單

4、個限制性內(nèi)切酶酶切鑒定 。結(jié)果： 構(gòu)建了含有 P D X - 1e D N A的真核表達(dá)載體 p E G F P - P D X - 1 。結(jié)論： 將 P D X ． 1 插入 p E G F P ． C 1 的 C ． 末端， 提高 P D X - 1 在真核細(xì)胞中的表達(dá)， 而且不影響其目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能， 對研究 P D X 一 1 調(diào)控肝干細(xì)胞的定 向分化機 制具 有重 要的意義 。．[ 關(guān)鍵詞] P D X - 1 ； 基因表

5、達(dá)； 綠色熒光蛋白； 聚合酶鏈反應(yīng) [ 中圖分類號 ] R 3 2 1 ． 5[ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ] ACo n s t r u c t i o no fma mma l i a ne x p r e s s i n gv e c t o rp EGF P- P DX- 1S U NX i a o — y a h， W E IB o， A NJ i n g( 1 ． I n s t i t u t eo fB a s i cM e d i

6、c a lS c i e n c e s ，G e n e r a lH o s p i t a l ， B e i j i n g1 0 0 8 5 3 ， C h i n a ； 2 。 D e p a r t m e n to f G en er a lS u r g e r y ，G en er a lH o s p i t a l ， B e i j i n g1 0 0 8 5 3 ， C h i n a ； 3 。 D e

7、 p a r t -m e n to fH i s t o l o g ya n dE m b r y o l o g y ， N a n f a n gM e d i c a lU n i v e r s i t y ， G u a n g z h o u5 1 0 5 1 5 ， C h i n a )[ A b s t r a c t ]O b j e c t i v e ： T os t u d yt h ei n d u c

8、t i o nm e c h a n i s mo fP D X - I ， t h ek e yg e n et or e g u l a t et h ed e v e l o p m e n to fp a n c r e a t i ce n d o c r in ec e i l s ，d u r in gt hed i f e r en t i a t i o no fh e p a t i cs t e m c e i

9、l si n t oi n s u l i n - p r o d u c i n gc e i l s ，w et r yt oc o n s t r u c tama mma l i a n - e x -p r es s i n gv e c t o rc a r r y i n gP D X- 1t os e a r c hf o rap r o p e rw a yt oi n d u c et hed i f e r e n

10、 t i a t i o no fh e p a t i cs t e m c e l l si n t oi s l e tB- c e i l sf r o m g e n i el e v e 1 ．M e t h o d s ： A l le x p e r ime n tme t ho d sa r ep e r f o r me da c c o r d i n gt ot h es t a n d a r dp r o

11、t o c o l so fmo l e c u l a rc l o n et e c h n o l o g y ．P o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n( P C R)w a su s e dt op r o l i f e r a t eP D X - 1e D N Af r o mS K 9 0 o ／ B L s C R I P rp l a s m i d ， p r o d

12、 u c i n ga n 8 5 8 b pb a ndw i t hH i n dma ndB a m HIa tb o t hs i d e so ft heD N A ．C l o n e dP D X - 1e D N Ai n t ot h eMC So fp E G F P - C 1t og e tar e c o m b i n e dm a m m a l i a n e x p r e s s i n gp l

13、 a s mi dp E G F P - C 1 - P D X - 1 ． t he nS m aId i g e s t e da nds e p a ra t e db y0 ． 8 ％ a g r o s eg e lt oi d e n t i f yt h er e c o m-b i n e dp l a s mi d ． Re s u l t s ~ Wec o n s t r u c t e ds u c c e s

14、s f u ll yama mma li a n - e x p r es s i n gv e c t o rp E GF P- P DX- 1 ．T h er e c o m b i n e dp l a s mi dh a st hes a meo p e nr e a d i n gf r a m ea 8p E GF Pa n dp e r f e c tp o t e n t i a l t ot r a n s l a

15、t ea n de x p r e s si nt hema mma li a n c e l l s ．Co n c l u s i o n： P DX-1w a s c l o n e di n t ot heCt e r m i n u so fp EGF P- C 1 ． U n d e rt h ec o n t r o lo fe n h a n c e ra n dp r omo t o ro fp EGF P— C

16、 1 ，P DX- 1w o u ldb ee x p r e s s e da s f u s i o n sw i t hp E G F P - C 1 ，i n c r e a s i n gt h et r a ns l a t i o ne f ic i e n c yo fP D X 一 1i nm a m m a l i a nc e l l sw it ho u tc h a n ~ n gt hes t r u c

17、t u r ea n df u n c t i o no fi t st r a n s l a t i n gp r ot e i n ．I na d d i t i o n，t her e c o mb i n e dv e c t o rc h o o s e sG F Pa s ar e p o r tg e n et op e r m i tt hep o s i t i v ec e l l st ob es e l e

18、c t e di nas i mp l ewa y f r o m t h ep r i ma r yc e l ll e v e 1 ．[ K e yw o r d s ] P D X - 1 ； g e n ee x p r e s s i o n ； p E G F P ； P C R本 研 究 旨在 提 高胰 十 二指 腸 同源 盒基 因· l( p a n c r e a t i c — d u o d e n

19、a lh o m e o b o x1g e n e ， P D X — 1 ) 在真 核細(xì)胞中的表達(dá) ， 不影響其 目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能 ，從 基 因水 平研 究胰 腺 內(nèi)分 泌 細(xì)胞發(fā) 育關(guān) 鍵基 因【 收稿 日 期 】 2 0 0 4 - 1 1 - 2 0【 修回 日 期 】 2 0 0 5 - 0 1 — 1 5【 基金項目】 廣東省科研基金資助項 目( 2 0 0 4 B 3 4 0 0 1 0 0 7 )[ 作者簡介 】

20、孫曉艷 ( 1 9 7 9 - ) ， 女 ， 遼寧本溪市人 ， 醫(yī)學(xué)碩 士 ， 助理研究 員。E m a i l ： y a n z i s u n 1 9 7 9 @s i n a ． c o mP D X 一 1 在肝干細(xì)胞定 向分化 中的調(diào)控機 制， 為胰 島B 一 細(xì)胞發(fā)育 、 胰島素表達(dá)的基 因調(diào)控機制提供理論 參考。1 材料和方法 1 ． 1試劑及來 源 限制性 內(nèi)切酶 B a m HI 、 H i n dⅢ、 T 4D

21、N A連接酶 ( 以上試劑均購 自 B i o L a b s ， N E W E N G L A N D ) ， S m aI( 購 自大連寶 生物工 程有限公 司) ， P f uM a s t e r M i x ( 購 自天為時代生物技術(shù)公司) ，維普資訊 http://www.cqvip.com A醫(yī) 進(jìn) 修 學(xué) 院 學(xué) 報 2 0 0 5D e c， 2 6 ( 6 ) JP L AP o s t g r a dM e dS

22、 c hA e a d? ?2 ． 7p E G F P — C 1 一 P D X 一 1真核表達(dá)重組子的酶切反 應(yīng)鑒定( 圖 4 ) S m aI 單個 限制性 內(nèi)切 酶反應(yīng)鑒定 ，重組子 1 含有兩個 目的條帶 ， 重組子 2 、 p E G F P — C 1陽性對照只有一個酶切片斷。因此重組子 1 為研究 所需要的含有 P D X 一 1c D N A而且插人方 向正確 的真 核表達(dá)載體 。3 討 論 P D X 一 1 是胰

23、島 內(nèi)分 泌細(xì)胞群發(fā)育 的主控基 因，又稱為胰島素啟動子因子 一 1 ( i n s u l i np r o m o t e rf a c t o r1 ， I P F 一 1 ) 、 胰島十二指腸 同源盒一 1 ( I D F 一 1 ) 等 。P D X ． 1 首先在發(fā)育 8 d的小 鼠胚胎中發(fā)現(xiàn) ， 胰腺形成 過程中逐漸集中表達(dá) 于 B 一 細(xì)胞和 6 一 細(xì)胞。1 9 9 5年 R o l a n dS t e i n 報

24、道人類的同源區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子 I P F 一 1 基 因定位于染色體組 的 1 3 qu。該基因的5側(cè)翼區(qū) ( 5一 f l a n k i n gr e g i o n )含 有 三 個 核 高 敏 感 位 點 ( n u c l e a s eh y p e r s e n s i t i v es i t e ，H S S )， 許多 轉(zhuǎn)錄 調(diào) 控 因子如 H N F 一 3 B 、 H N F 一 1 儀 、 H N F - 4 c

25、 t 及 P D X 一 1 蛋 白與核高敏感位點相結(jié)合 ， 調(diào)控其靶基 因( 如 G L U T 2 、L — p y r u v a t ek i n a s e ) 的表 達(dá) 。胚 胎 育 過 程 中，P D X 一 1 對胰腺尤其是 B 一 細(xì)胞、 儀 一 細(xì)胞 的發(fā)生、 發(fā) 育具有重要的調(diào)控作用。另外 ， P D X 一 1 和其它細(xì)胞 因子在 內(nèi)的多種生物 因子 ， 如胰腺發(fā)生早期 內(nèi)分泌 腺組織豐富表達(dá)的肝細(xì)胞核因子 (

26、h e p a t o c y t en u c l e a rf a c t o r ， H N F ) 等 卜， 協(xié)同作用于調(diào)控胰島激素合成 的基 因網(wǎng)絡(luò)。因此 ， P D X 一 1 具有雙功能 ： 促進(jìn)胰腺的 早期發(fā)育和較晚期 p 一 細(xì)胞的分化 ； 在成熟 p 一 細(xì)胞 中 維持 B 一 細(xì)胞的形態(tài)和正常功能 ， 尤其是胰 島素分泌 基 因的正常運行 。R o l a n dS t e i n 教授贈送的質(zhì)粒 S K 9 0

27、 0 ／ B L S C R I包含 P D X 一 1c D N A ， 位于載體 中兩個 限制性 內(nèi)切 酶 B a m HI 位點之間 ， 全長 8 5 8 b p 。將 s I ( 9 0 O ／ B L s c R I f y r進(jìn)行測序 ， 利用 V e c t o rN T I 軟件對測序結(jié)果 和通過 G e n e b a nk 檢索得 到的大 鼠 P D X 一 1c D N A進(jìn)行相關(guān) 性 的 比較 分 析 ， 結(jié)果

28、發(fā)現(xiàn) 二 者 的符 合 程 度 達(dá) 到1 0 0 ％。整個表達(dá)載體構(gòu)建過程完全依照經(jīng)典 的基 因工 程 操作 規(guī)程 ： S K 9 O O ／ B L S C R I P T質(zhì) 粒擴(kuò) 增 、 提 純 ； 梯 度 P C R 從 S K 9 0 0 ／ B L S C R I P T 質(zhì) 粒 中 擴(kuò) 增 P D X 一 1 ， 并在其 5末端用一個 H i n d 1 I I 限制性 內(nèi)切酶 位點替換 B a m HI 位點 ； P C

29、R產(chǎn)物進(jìn)行 回收、 純化 ；雙酶切反應(yīng) ( H i n d 1 I I 、 B a m HI) 得到需要 的 P D X 一 1片段 ， 并使其按照正確的方 向克隆至相 同雙酶切反 應(yīng)回收得到的 p E G F P — C 1 線性載體的多克隆位點之 中； 最后 ， 對重組子進(jìn)行 S m aI 酶切鑒定 。本研究是 · 4 2 3 ·肝干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰 島 B 一 細(xì)胞機制研究 的前期 工作 。P D X 一 1

30、插人 p E G F P — C I 的 c 一 末端 ， 在 p E G F P —c 1 啟動子 的作用下與 p E G F P — C 1 表達(dá)形成 融合蛋 白， 提高 P D X 一 1 在真核細(xì)胞 中的表達(dá)， 同時不影 響其 目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能 U ， “ J ， 減少外源性基因表 達(dá)產(chǎn)物對肝 干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島 B 一 細(xì)胞 這一體 系的影響。另一方 面， p E G F P — C 1 一 P D X 一 1以 G

31、F P作 為報告基因， 便于原代細(xì)胞水平上的快速篩選 ， 提高 轉(zhuǎn)染效率 ， 減小細(xì)胞損傷； 有利于我們模擬胰腺體內(nèi)發(fā)生 、 發(fā)育的基因?qū)哟涡员磉_(dá)調(diào)控環(huán)境 ， 從基因水平 研究 P D X 一 1 在肝干細(xì)胞定 向分化 為胰 島素分泌細(xì) 胞 中的調(diào)控作用。因此 ， p E G F P - C 1 一 P D X 一 1真核表 達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建對肝干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化為胰島素分泌 細(xì)胞 的深人研究具有重要的意義。[ 參考文獻(xiàn) 】[1 ] C a

32、s t r o n o v oV， K u s a k aM， C h a r i o tA ．H o m e o — b o xg e n e s ： p o t e n -t i a l c a n d i d a t e sf o rt h et r a n s c r i p t i o n a lc o n t r o lo ft het r a n s f o r me da ndi n v a s i v ep h e

33、n o t y p e [ J ] ．B i o c h e m i c a lP h a r m a — c o l o g y ， 1 9 9 4 ，4 7：l 3 7 ． 1 6 6．[ 2 ] H u iH， P e r f e t t iR ． P a nc r e a sd u o d e n u mh o m e o b ox - 1r e ga t e sp a n-c r e a s d e v e l o p me

34、 n td u r in ge mb r y o g e n e s i sa n di s l e tc e l lf u n c t i o ni na d u l t h o o d [ J ] ． E u r o p e a n JE n d o c r i n o l o g y ， 2 0 0 2 ， 1 4 6： 1 2 9 - 1 4 1 ．[3 ]S t o f e lM，S t e i nR， Wr i s a t

35、C V ．L o c a l i z a t i o no fh u m a nh o m e -o d o m a i nt r a n s c r i p t i o nf a c t o ri n s l ~ l i np r o m o t e rf a c t o r1( I P F 1 )t oc h r o m o s o m eb a nd l 3 q l 2 ． 1 [ J ] ． G e n o m i c s ，

36、1 9 9 5 ， 2 8 ： 1 2 5 — 1 2 6 ．[ 4 ]WuK L ，G a nn o nM，P e s h a v a r i aM．H e p a t o c y t en u c l e a rf a ct o r31 3 i si n v o l v e di np a nc r ea t i cB - c e l l - s p e c i f i ct r a n s c r i p t i o no ft

37、h ep d x 一 1g e n e [ J ] ． M o lC e l lB i o l ， 1 9 9 7 ， 1 7 ： 6 0 0 2 - 6 0 1 3 ．[ 5 ] G e r r i s hK ， G a n n o nM， S h i hD ． P a nc r e a t i cBc e l l — s p e c i f i ct r a i l -s c r i p t i o no ft hep d x -

38、1g e n e [ J ] ． JB i o lC h e m， 2 0 0 0 ， 2 7 5 ： 3 4 8 5 -3 4 9 2．[ 6 ] E d l u n dH ．D e v e l o p m e n t a lb i o l o g yo ft h ep a n c r e a s[ J ] ． D i a b e t e s ，2 0 0 1 ， 5 0( S u p p l1 ) ： $ 5 - 9 ．[ 7 ]

39、D u n c a nS A ， N a v a sM A ， D u f o r tD ． R e g l t d a t i o no faT r a n s c r i p t i o nF a c t o rN e t w o r kR e q u i r e df o rD i f e r e n t i a t i o na ndM e t a b o l i s m[ J ] ．S c i e n c e，1 9 98，2

40、 8 1：6 9 2 - 6 9 5 ．[8 ] B a r b a c c iE ， R e b e r M， O t t M ． V a r i a nth e p a t o c y t en u c l e a rf a c t o r 1i sr e q u i r e df o rv i s c e r a le n d o d e r ms p e c i f i c a t i o n [ J ] ． D e v e l

41、 o p m e n t ，1 9 9 9，1 2 6： 4 7 9 5 - 48 0 5．[ 9 ] C o f i n i e rC ， T h e p o tD ， B a bi n e tC ．E s s e n t i a lr o l ef o rt h eh o m e o -p r o t e i nv HN F 1 ／ HN F 1b e t ai nv i s c e r a le n d o d e r m d

42、i f e r e n t i a t i o n[ J ] ． D e v e l o p m e n t ， 1 9 9 9 ， 1 2 6 ：( 2 1 ) ： 4 7 8 5 - 4 7 9 4 ．[ 1 0 1H a a sJ ， P a r kE C ， S e e dB ． C o d o nu s a g e l i m i t a t i o ni n t h ee x p r e s -． s i o no fH I

43、 V - 1e n v e l o p eg l y c o p r o t e i n[ J ] ．C u r rB i o l ，1 9 9 6 ，6 ( 3 ) ： 3 1 5 - 3． 2 4．[ 11 ]MK o z a k ．A na na l y s i so f5 ： n o n c o d i n gs e q u e n c e sf r o m6 9 9v e r t e —b r a t em e s s e n